2013 Fiscal Year Research-status Report
病原性真菌におけるスフィンゴ脂質様マイコトキシン産生機構の解明
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25440036
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Osaka Medical College |
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Principal Investigator |
生城 浩子 大阪医科大学, 医学部, 講師 (10280702)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | スフィンゴ脂質 / 酵素 / フモニシン / セリンパルミトイル転移酵素 |
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| Research Abstract |
① フモニシン合成酵素のkey unitをコードする遺伝子のクローニングと発現系構築
フサリウム菌ゲノムDNAは理研バイオリソースセンターより購入し，これを鋳型に用い，フモニシン合成酵素クラスターからkey unitであるFUM8およびFUM13両遺伝子をPCRクローニングした。Fum8pに関して，発現宿主である大腸菌株・発現ベクターの組み合わせを検討し，大腸菌内大量発現系構築を試みた。組み換えFum8pの大腸菌内発現には成功したが，その量は微量であり，水溶性画分には局在していなかった。
② セリンパルミトイル転移酵素（SPT）について
SPTサブユニットの大腸菌内発現に成功したが，培養条件によって発現量が一定せず，可溶性タンパク質としての収量が極めて低いため，条件検討を重ねている．組み換えタンパク質の精製には至っていない．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Fum8pは精製のために付加したタグの領域まで含めると分子量が10万を超えるかなり高分子量のタンパク質である上に，疎水性が高い性質があるために，大腸菌内で発現させるのは技術的な困難がある．申請者が従来取り扱ってきた水溶性タンパク質の大腸菌内発現系ではFum8pを安定に大量発現するためには更なる技術的な工夫が必要であり，現在もその検討の途中である．したがって、組み換え精製標品が得られてから遂行可能になる実験は現段階ではまだ実行に移れない状況であり，このために、当初の実験計画より進捗が遅れてしまっている．
SPTに関しても，目下，発現量の増加と可溶性画分に安定して発現するような条件を検討している．精鋭酵素標品が安定供給できる状態にならないために遅れを生じている．
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| Strategy for Future Research Activity |
Fum8pに関してはタンパク質の疎水性度を挙げる原因と目されるN末領域の欠失変異体を作成し，可溶性画分に大量発現するように発現系を改良する．また、酵母を用いた発現系を構築する．
SPTに関しては培養条件を詳細に検討し，発現系の改良をさらに進める．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当初計画していた実験のうち，精製組み換えタンパク質を使った活性測定が，組み換えタンパク質の発現系構築が難行している理由から十分に遂行できず，活性測定用の基質の購入費に計上していた試薬代が次年度使用額として繰り越す結果となった．
組み換えタンパク質の発現系を改良するための人工遺伝子作成代金，培養条件を最適化するための特殊培地，あるいは大腸菌以外の発現宿主を試すためのキットや試薬の購入費用に活用する予定である．
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