2013 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
25440038
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Research Institution | Hokkaido University |
|---|
Principal Investigator |
小原 圭介 北海道大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (30419858)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | 細胞膜 / 脂質 / 脂質非対称 / 情報伝達 / 生体膜 / 出芽酵母 |
|---|
| Research Abstract |
平成25年度は、（1）脂質非対称センサーであるRim21の解析、および（2）乱れた脂質非対称への適応過程で中心的に働く新規因子Opt2の解析を進めた。
（1）Rim21の解析：センサーモチーフが内包されているC末端の細胞質領域（Rim21C）の変異解析を行った。その領域内の荷電アミノ酸残基が細胞膜の荷電脂質との結合・解離を繰り返しながら脂質非対称の状態を感知する、と言う仮説に基づき、荷電アミノ酸残基に着目した。その結果、酸性残基クラスターの1つがRim21を最上流とする情報伝達経路（Rim101経路）に必須である事を見出した。Rim21Cのみの部分とGFPとの融合タンパク質（GFP-Rim21C）として発現させると、通常は細胞膜に結合し、脂質非対称の乱れに応じて細胞膜から解離して細胞質へ拡散した。しかし、この酸性残基クラスターをアラニンに置換した変異種では、細胞膜からの解離が大きく抑制された。この事は、このクラスターが脂質非対称センサーモチーフの中心を為す事を物語っている。細胞膜の脂質に目を向けると、ホスファチジルセリン（PS）が存在しない変異体では、Rim21Cが細胞膜から解離した事から、センサーモチーフが少なくともPSを認識している事が示唆された。
（2）Opt2の解析：Opt2の分子・細胞レベルでの機能を調べた。PSやホスファチジルエタノールアミン（PE）に結合して毒性を示す薬剤に対する感受性試験、外層に露出したPEの可視化、蛍光標識したリン脂質の取り込み実験を行ったところ、これら全ての実験の結果が、Opt2が新規のリン脂質フロッパーゼである事を示唆した。脂質非対称の乱れに対する適応過程で、Opt2がリン脂質のフロップを通して寄与している様子が見えてきた。また、糖鎖修飾を受けない事、N末端とC末端の両方が細胞質に存在する膜トポロジーをとっている事などを明らかにするなど、今後の解析に欠かせない基礎知見の取得に成功した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度は、Rim21Cの変異解析によりRim101経路の活性化に必須なアミノ酸残基を同定する予定であった。変異解析により、Rim101経路の活性化に酸性残基クラスターの一つが必須である事を明らかにした。さらに、このクラスターが脂質非対称の状態の感知に直接的に関わる事、即ちセンサーモチーフの中心であることも明らかにした。この事は、予定を上回る成果である。また、GFP-Rim21Cの動態解析も行い、センサーもチーフが少なくとも細胞膜内層のPSを認識している事を見出した。この成果は、脂質非対称センシングに関与する細胞膜内層側の因子を一部明らかにした点で大いに評価できる。しかし、その他の荷電脂質の関与、また精度の高い定量解析など、一部で達成できなかった課題もある。また、Rim21Cの組み替えタンパク質を作成し、in vitro実験を行う計画であったが、当該組み替えタンパク質の収量が低く予定よりも遅れている。
Opt2に関しては、翻訳後修飾、膜トポロジーなどの基礎知見を得る予定であった。これは、概ね達成できた。また、蛍光標識したリン脂質の取り込み実験からOpt2がリン脂質のフロップに直接関わる事を示唆し、当初の計画を達成できた。さらに、OPT2遺伝子の欠損により外層へのPEの露出が減少する事を直接可視化する事に成功した。これは、計画を上回る成果である。
この様に計画を上回る成果を得た項目がある一方で、当初の予定を達成できない部分もあった。これらを総合し、研究計画に照らし合わせると、本研究は概ね順調に進行している、と判断できる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成25年度に得られた成果を受けて、引き続き乱れた脂質非対称の感知と修繕機構を明らかにすべく研究を推進する。Rim21による脂質非対称感知機能の解明に向けて、Rim21Cの組替えタンパク質の大量発現、精製を行う。精製した組替えタンパク質と様々な脂質組成の脂質ナノディスクや人工膜小胞リポソームとの相互作用を調べる。相互作用の検出には、表面プラズモン共鳴の測定、FRET法、pull-down法などを用いる。さらに、脂質との結合に際して起こり得るRim21Cの構造変化を、CDスペクトルの測定や熱安定性の検定で明らかにする。構造変化が見られた場合は、NMRを用いた構造変化の完全解明を目指し、安定同位体ラベルなどの条件検討を行う。細胞膜内層の脂質については、細胞膜内層に存在し、強い負電荷を有するPtdIns(4)PやPtdIns(4,5)P2に注目し、それぞれの合成酵素変異体での、Rim101経路の活性化を調べる。またGFP-Rim21Cの動態も追跡し、センサーモチーフがこれらの脂質を認識するか否かを明らかにする。
Opt2に関しては、変異解析や部分欠失変異体の作成を通して、Opt2の活性に必須なアミノ酸残基や領域を見出す。野生型および活性を失った変異体を酵母細胞中で過剰発現し、そのミクロソーム画分を用いてフロップ活性を測定する。フロップ活性の測定は、蛍光標識したリン脂質のミクロソーム膜内層（内腔側）への移行を蛍光分光光度計で測定する。平成25年度にOpt2のN末端およびC末端が細胞質側に存在する事を明らかにした。そこで、N末端もしくはC末端に精製用のタグを付加し、ミクロソーム小胞の外側にN,C末端が向いたトポロジーの小胞を回収する事で、実験の精度を上げる。
|
| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成25年度の研究が概ね順調に進み、繰り返し行う条件検討などに掛かる消耗品の費用が少なく済んだため、次年度使用額が生じた。
研究成果を発表するために学会に参加したが、航空券の早めの取得等により、予定よりも旅費が少なく済んだのも理由の一つである。
平成25年度に予定通りに進行しなかった部分の研究に力を入れる。この部分は、高額な試薬を複数必要とするため消耗品費用が多額になる。そこで、主に消耗品費用に充てる。
|
Research Products
(6 results)
