2014 Fiscal Year Research-status Report
MAPキナーゼ活性化動態の可視化と操作によるストレス応答特異性決定機構の解明
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25440043
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
冨田 太一郎 東京大学, 医科学研究所, 助教 (70396886)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ストレス応答キナーゼ / ストレス応答 / イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではストレスなどの刺激を受けた細胞が、その刺激に適した細胞応答を誘導するメカニズムについて解析する。特に、MAPK経路では、刺激毎にシグナルの細胞内動態が異なることが明らかになりつつある。そこで、MAPK活性化の細胞内動態の違いが刺激に対する細胞応答の特異性を決定する可能性について検証する。
昨年度までに、各種ストレス応答MAPKシグナルの活性化を単一細胞で実時間に可視化測定することに成功していた。そこで、本年度はさらにMAPK活性化を操作する実験系の構築を中心に行った。今回、MAP2Kと呼ばれるMAPK活性化キナーゼに光制御可能な多量体化ドメインを融合させる方法によって、光照射に伴ってMAPK活性を誘導できることを見いだした。また、この方法とは別に、他の研究者からはMAPK分子の内部に多量体形成ドメインを挿入する方法が既に報告されていたが、この手法にMAPK可視化系を組み合わせた場合には、試薬の添加によりMAPK活性化を操作しながらイメージングできることが分かった。従来法では定量しながらの操作は非常に困難であったが、これまでに作製した可視化系と操作実験系を組み合わせることによって、リアルタイムにキナーゼ活性を定量しながら任意のレベルにまでMAPK活性を操作できるようになった。
MAPKシグナルは細胞の分化や増殖にも関与し、また、種々の炎症性疾患や神経疾患、さらに、神経の再生誘導や抗がん剤の作用メカニズムとしても非常に重要であるが、細胞内動態やその機能的役割については不明な点が多い。本年度に作製した実験系を用いて単一細胞での定量的な評価を行うことで、「MAPKシグナルの強さ、タイミングと細胞内局在」とその結果生じる「細胞機能」との対応が明確になるものと思われる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度には、哺乳類培養細胞に適用可能なストレス応答キナーゼ活性制御系を実現し、さらに、同時に細胞内キナーゼ活性化をイメージングする系を組み合わせることによってリアルタイムにキナーゼ活性を任意に調節できるようにすることを目標とした。研究実施により、実際に試薬の添加あるいは光照射によってMAPK活性を任意のレベルにまで亢進できることが分かったため、おおむね順調に進展しているといえる。従来、1時間～数時間程度必要だったMAPK活性誘導を、この新しい方法ではわずか数分～10分程度で行えるようになったが、この手法はストレス応答シグナルの「活性化のタイミング」が細胞機能に及ぼす効果を解析する次年度計画の基盤となる。また、細胞内局所のMAPK活性化などの空間的なパラメータの影響についても任意の場所に光照射を行うことで解析が可能になってきた。期待通りの結果であるが、このような光照射による分子活性操作は現在までにほんの一握りの分子種でしか達成されていないため、今後、シグナル研究分野において世界的な波及効果が見込まれる重要な成果と言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度にはストレス毎のMAPK動態の違いが明確になり、次年度にはMAPK活性制御実験系が構築できた。そこで、最終年度では、予定通りにストレス応答MAPK活性化の「時間、空間動態」を変化させたときの細胞応答を解析し、その生理的役割の解析を行う。
まず、細胞内局所のMAPK活性化を誘導して、その有無によるストレス応答の変化を解析する。次に、シグナル活性化のタイミング、持続時間などの時間的な動態を変化させて、その影響を解析する。また、今年度までの研究成果から、同じシャーレの細胞集団の中でも細胞毎にMAPK活性化の動態が様々に異なる場合があることが見いだされている。そこで、単一細胞レベルの応答多様性が細胞集団の応答にどのような生理的な役割を持つのかについても解析を行う。
これらの実験からMAPKシグナルの時間・空間的な動態が細胞のストレス応答にどのような寄与をするのかを解明する。
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