2013 Fiscal Year Research-status Report
膜受容体・エフェクタータンパク質を構成した人工細胞システムによるシグナル伝達解析
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25440045
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
湊元 幹太 三重大学, 工学(系)研究科(研究院), 講師 (80362359)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 人工細胞モデル / 細胞情報伝達 / リポソーム / 膜タンパク質 / 分子生物工学 / バキュロウイルス / プロテオリポソーム / アデニル酸シクラーゼ |
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| Research Abstract |
本研究では、細胞のシグナル伝達経路を、その構成要素を、人工脂質2分子膜ベシクル（巨大リポソーム）の膜界面に再構成することによって、少数ながら個別の要素の統合により伝達機能の発現を行おうとしている。とくに、ホルモン等の細胞外からのシグナル分子の受容に始まる膜受容体経路とその下流に在って活性化されるエフェクター、そして、情報の流れを感知する仕組みを同時に組み入れた、人工細胞システムに見立てたリポソームを作製することを目標とした。このため、Gタンパク質共役受容体（GPCR）の経路をモデルに、機能に必要な要素のセット（Gタンパク質、アデニル酸シクラーゼAC）とシグナルに応答するセンサー（cAMPにより活性化する酵素PKAあるいはチャネルCNG）とを組込むことに取り組んだ。組込みには、私たちの開発手法（要素の遺伝子を組み換え田バキュロウイルス出芽粒子（BV）が目的の膜タンパク質を提示することと、弱酸性により活性化される融合誘起タンパク質GP64が人工膜とBVとの膜融合を引き起すこととを利用したプロテオリポソーム調製法）を用いた。
既に幾つかの組込み例を得ており、今年度は、界面通過法（張合せ法、droplet-transfer法）または静置水和法で調製した巨大リポソームを使って解析した。蛍光染色BVをリポソームと種々のpH条件（4-6）で混和し融合曲線を描いた。
また、GPCR経路の膜上の終端、ACの再構成をし、プロテオリポソームによる活性検出を行った。即ち、ACのC末端にfolding reporterにもなる蛍光タンパク質タグを融合し提示したBVが調製されていることを、ウエスタンブロットにより確認し、融合後の巨大リポソーム膜上に取り込まれたことを確認した。基質（ATP）封入AC再構成リポソームをフォルスコリンで活性化し、特異的なcAMP産生を競合ELISAにより検出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、解析する対象である人工細胞システムの構築・改良のため、モデルとするGPCR経路の再構成と感知システムの構築を行うことを目標とした。経路の構成要素（GPCR・Gタンパク質・アデニル酸シクラーゼ）の各遺伝子の入手と、ウイルス作製は、本課題開始以前からの研究の蓄積もあり、済んでいる。GPCR経路の構成要素（GPCR、3量体Gタンパク質、アデニル酸シクラーゼ）Folding reporterとしての蛍光タグやHisタグを融合した遺伝子を組み込んだバキュロウイルス粒子も準備できている。従来の静置水和法で調製した巨大リポソーム膜上に、これらの膜タンパク質が、酸性条件におけるBVとリポソームとの膜融合を経て組込まれたことを、蛍光顕微鏡によるタグタンパク質による蛍光を観察することで確認できた。組込まれたACの活性を検出するため、ATPを封入した巨大リポソーム懸濁液とAC組換えBVを融合後、外液を交換、AC活性化のためフォルスコリンを添加し、cAMPの産生を競合ELISAにより調べた。同時に封入した阻害剤SQ 22536の特異的作用が見られたことから、AC機能の再構成されたことが確認された。また、シグナルの感知のシステムの一つとして、環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルCNGの組込みを考え、適当なサブユニットの選択（CNGA2, CNGA4, CNGB1）と蛍光タグとの融合、これを提示するバキュロウイルスの作出に取り組み、ある程度進められた。一方で、アンサンブル試料を基にした解析の困難さも明らかとなり、単一の巨大リポソームによる直接解析が可能となるよう、界面通過法によるリポソームとウイルスとの膜融合の検討も併せて行った。当初の予定にあった非蛍光タグによる解析、リガンド修飾ガラスの調製についても、次年度以降、引き続き取り組む。今年度の研究目標は、概ね、順調にできたと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、前年度に引き続き、解析する対象である人工細胞システムの構築・改良のため、モデルとするGPCR経路の再構成と感知システムの構築を行うことを目標とする。前年度までに、巨大リポソームをターゲットとして、シグナル伝達経路の要素となる膜タンパク質を、組換えBVとの膜融合により確実に送り込める可能性が可なり広がった。今年度は、特に、要素数を増し、複数の要素タンパク質の巨大リポソーム膜への取込と統合の実現を図る。昨年度、エフェクタータンパク質の酵素活性を再構成可能であることを示した。しかし、アンサンブルの試料による活性検出の難しさも認識できた。そこで、今年度は、特に、エフェクター活性について単一の巨大リポソームのレベルで調べられるシステムを構築することを推進する。具体的には、エフェクター酵素（膜タンパク質）のはたらきで生じる物質を感知するセンサータンパク質などを、リポソーム内部に構成していく。本研究ではcAMPに応答するものとして、環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネル(CNG)、あるいは、タンパク質キナーゼA(PKA)を想定する。また、cAMPとの結合で蛍光特性の変化する蛍光タンパク質センサーの利用も検討したい。CNGの組込みは、組換えBVの作出が前年度までにほぼ終了しており、今年度、構成実験に移行できる。PKAは、巨大リポソーム上でのcAMP検出を検鏡で得た画像情報に反映されるようにするために、遺伝子工学的な工夫が必要となる。ウイルスエンベロープタンパク質GP64のC末端側(細胞質側)に、cAMPと結合し乖離する、PKAの制御サブユニットを連続させ、蛍光タグ付したPKAの触媒サブユニットをリポソーム内部に封入する案を、検討対象としたい。GPCRに対するリガンドによる修飾ガラスの調製についても、併せて取り組む課題としたい。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本研究は、概ね、順調に進展しており、当初額からの著しく大きな差は生じていないものと考えているが、次年度使用額が生じた理由として、（１）本年度（H25年度）は、他研究と関連学会等が重複するなどし関係旅費を、本科研費以外から支出したケースがあったことと、（２）本実験に関わる実験消耗品で、細胞培養等に必須の培地類、プラスチック製品などのコストを可能な限り抑えようと努めたこと、などが挙げられる。
次年度使用額は、次年度請求額と併せて、次年度の研究遂行のために、適切に使用する予定である。具体的には、細胞培養等の維持に、継続的に必要となる物品、試薬類の購入、旅費、謝金等、に充てる。また、研究提案時には、その影響について十分に想定できなかった、次年度、次々年度における消費税の増税、ならびに、最近の円安誘導に起因する、わが国における輸入品を含む全物品の値上がり傾向に鑑みれば、次年度使用額は、その増分に充当する形となると思われる。今後も、コスト削減等による効率的かつ効果的な研究費の支出に努める。
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