2014 Fiscal Year Research-status Report
活性型GPCRマーカーを用いたGPCRシグナルの制御機構の解析
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25440054
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
十島 二朗 東京理科大学, 基礎工学部, 准教授 (00333831)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | GPCR / エンドサイトーシス / クラスリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度計画に沿って以下の研究を実施した。「活性化GPCRの選択的エンドサイトーシス機構」については、酵母のGPCRであるSte2受容体を用いて、そのクラスリン被覆小胞への取り込みについて蛍光標識および放射標識により活性化GPCRのエンドサイトーシス機構を解析した。昨年度の研究により同定したホスファチジルセリン(PS)の合成酵素であるCho1の変異体について、その局在と機能について詳細に解析した。さらに、フォスファチジルイノシトールキナーゼであるStt4について、その遺伝子の欠損により活性化GPCRのクラスリン被覆小胞への取込みに著しい異常が生じることを明らかにした。現在、Stt4pおよびCho1による細胞膜脂質成分のエンドサイトーシスに与える影響を解析している。
「活性化GPCRのリソソームへの輸送機構（分解機構）の解明」については、本年度の計画通り、昨年度の蛍光標識マーカーを用いた酵母遺伝子欠損変異体ライブラリーのスクリーニングにより同定した変異体の解析を行った。昨年度のスクリーニングにより、活性化GPCRのリソソームへの輸送に異常がある195種類の変異体について、アクチン骨格、細胞膜内リン脂質等の細胞内分布が野生型と比べて異常であるものについて、詳細に解析を行った。この結果、約10種類の変異体で細胞内のアクチンフィラメントの形成が減少もしくは増加しているものが得られた。また、細胞膜内リン脂質については、リソソームでのPI3Pの発現量が著しく増加している変異体を同定した。これらの結果より、細胞内アクチンフィラメント、およびリソソーム内PI3PがGPCR輸送に関与していることが示唆された。現在、これらの変異体の遺伝子について、そのGPCR輸送における役割について解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究において、本研究計画で特に重要であったGPCRの輸送異常を示す変異体のスクリーニング完了し、いくつかの変異体の単離に成功した。さらに、得られた変異体について研究計画に従い解析中であり、これまでにそれらの機能分類、および機能未知タンパク質の解析が進行している。本研究課題は来年度（H27年度）が最終年度であるが、当初の目的を達することが可能であると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も今年度に引き続き、スクリーニングにより同定したタンパク質の機能解析を中心に行う。スクリーニングにより同定したタンパク質については同じ表現型クラスに含まれるものについて、物理的、遺伝学的相互作用をさらに詳細に調べ、新しい機能的複合体の同定を試みる。さらに、個々の機能未知のタンパク質についても、それらの細胞内局在、ドメイン構造、および遺伝子変異体の詳細な解析を行い、GPCRのリソソームへの輸送における役割を明らかにする。また、スクリーニングにより同定した変異体の中でリサイクリング経路にも異常を示す変異体の同定に成功したため、来年度はこれらのタンパク質によるGPCRのリサイクリング経路における輸送についても解析を行う。
また、Stt4pおよびCho1による細胞膜脂質成分（イノシトールリン脂質、PS等）の代謝がGPCRの輸送にどのような影響を与えるかについて明らかにする。これまでに、Stt4遺伝子の変異体ではGPCRのクラスリン被覆小胞への取り込みに異常があることを明らかにしているため、その分子機構を明らかにする。Cho1変異体では、特にGPCRのリサイクリングに異常生じていることを見出しており、細胞膜内のPSのリサイクリング経路における役割について解析を進める。
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| Causes of Carryover |
25年度に作製予定であったDNA合成が予定より若干少なかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
26年度に作製するDNA合成に使用する。
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