リアルタイム分泌測定のハイスループット化と細胞間相互作用解析法の開発

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25440074
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 白崎 善隆 独立行政法人理化学研究所, 統合生命医科学研究センター, 研究員 (70469948)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 単一細胞解析 / 分泌活性測定 / 全反射蛍光顕微鏡 / サイトカイン / イムノアッセイ

Research Abstract

１．研究の目的　免疫系の有する高いロバスト性がシステム的にどのように実現されているのかを解明することは、単に基礎生物学としてだけでなく、数多くの免疫系の破綻に由来する疾患の克服のためにも重要な意味を持つ。本研究では単一細胞レベルでの遺伝子発現の観点から免疫システムの構築・作動原理の解明に迫ることを目指す。この目的達成のために、本研究では、非侵襲的な遺伝子発現時系列解析として液性因子分泌活性を単一細胞レベルでリアルタイムに定量する方法を利用し、数百～数千個の免疫細胞からの分泌活性を秒～分オーダーの高い時間分解能で測定するシステムを開発する。
２．初年度の研究実績　初年度においては数百～数千細胞からのリアルタイム分泌測定システムの開発を行った。これまで研究実施者は対物レンズ型全反射顕微鏡システム上でリアルタイム分泌測定システムの開発を行ってきたが、この場合、高開口数の60倍対物レンズもしくは100倍対物レンズに制限されるため、十分な視野を確保できなかった。そこで、TIRF technology社 導波路型全反射照明装置を利用した広域全反射照明をシステムに導入することを検討した。この場合、石英ガラスを導波路基板とし、その上部に微細加工したシリコーンエラストマーPDMSで作成したマイクロウェルアレイを形成したが、PDMS・水の境界から励起光の漏れ込みが観測された。原因として屈折率の空間的不一致が考えられた。そこで、水と同等の屈折率を有するアモルファスフルオロポリマーCYTOPをPDMSと導波路のバインダーとして用いたところ、励起光の漏れ込みを低減することに成功した。
今後、CYTOPの厚みや加工法の最適化を行い、更なる励起光の漏れ込みの低減を行うとともに、実際の細胞からの分泌の測定を試みる予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の研究計画において、導波路型全反射照明法もしくはプリズム型全反射照明法の導入を計画していた。実際、まずは既成の照明装置が利用可能な導波路型全反射照明法を用いたシステム開発に取り掛かった。研究計画時点で懸念された通り、マイクロウェルアレイを形成する材質の高い屈折率によって正常な全反射照明ができなかったが、研究計画時点で対応策として用いることを構想していたＣＹＴＯＰ樹脂による接着層の導入により解決の糸口が見られた。このＣＹＴＯＰの導入においては、マイクロウェルアレイ材質であるＰＤＭＳとの接合工程及び、ウェル部底面に該当する部分のＣＹＴＯＰの除去工程の開発が必要であったが、ＰＤＭＳの表面修飾とＣＹＴＯＰ表面の活性化によって接合するプロセスを確立し、さらにこれまで報告があまりされていないＣＹＴＯＰのウェットエッチングを導入することでＰＤＭＳ表面に余分なダメージを与えることなくＣＹＴＯＰの選択的除去を可能とするプロセスを確立した。
上述の通り、初年度の課題である広域全反射照明法は達成されつつあり、おおむね順調に進展していると言える。

Strategy for Future Research Activity

初年度の検討によって、導波路型広域全反射照明システムが確立しつつあるが、微量の励起光の漏れ込みが未だ確認されている。これまでの単一細胞分泌測定の実験結果によると、単一細胞から分泌されるタンパク質量は微量のものも多く存在するため、出来る限り背景シグナルは低減した高感度測定が求められる。よって、微量の励起光の漏れ込みを除去するための更なる基盤改良を行う。具体的には、ＰＤＭＳの不透明化を行う。
背景シグナルの十分な低減を達成した後、取扱いが容易な株化細胞によるサイトカイン分泌測定を実施する。目標性能としては、40倍対物レンズ観察時200 wells /min、20倍対物レンズ観察時 800 wells/min、10倍対物レンズ観察時 3200 wells/minの観察速度を設定する。また、各対物レンズ使用時に実際の細胞からのサイトカイン分泌がどの程度のシグナル強度で観測されるかを検討する。この際に用いる蛍光色素としては、有機蛍光色素であるCy3、Cy5、また褪色特性が優れるCFdyeを検討する。また、ストークスシフトおよび蛍光強度で優れるQdotの評価も行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

当初評価用に計上していた抗体の使用量が少なく済んだため、剰余の予算を次年度予想される実際の細胞を用いての評価に必要な予算として繰り越しした。
繰り越し分の予算は、高感度検出の検討に必要な抗体および蛍光試薬の購入に使用することを検討している。また、マイクロウェルアレイの作製に必須なPDMS貫通穴アレイの外注が困難になったため、自作に必要なマスク、フォトレジスト等の購入にも使用する。

Research Products

• [Journal Article] Real-time single-cell imaging of protein secretion (2014)
  • Author(s): Y. Shirasaki, M. Yamagishi, N. Suzuki, K. Izawa, A. Nakahara, J. Mizuno, S. Shoji, T. Heike, Y. Harada, R. Nishikomori, O. Ohara
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 4 Pages: 4736
  • DOI: 10.1038/srep04736
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Real-time secretion analysis 64 revealed correlation of IL-1beta release and loss of cell membrane integrity (2013)
  • Author(s): Shirasaki Y, Yamagishi M, Izawa K, Nakagawa K, Nakahara A, Suzuki N, Mizuno J, Sekiguchi T, Heike T, Nishikomori R, Shoji S, Ohara O
  • Organizer: MicroTAS2013
  • Place of Presentation: Freiburg, Germany
  • Year and Date: 20131027-20131031