2014 Fiscal Year Research-status Report
ヘテロクロマチン再考:リボソームDNAにおける転写と組換えを指標とした解析
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25440090
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Research Institution | Takasaki University of Health and Welfare |
Principal Investigator |
常岡 誠 高崎健康福祉大学, 薬学部, 教授 (50197745)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
馬田 敏幸 産業医科大学, 大学共同利用機関等の部局等, 准教授 (30213482)
岡本 健吾 高崎健康福祉大学, 薬学部, 講師 (60437754)
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Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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Keywords | ヘテロクロマチン / ヒストン / H4K20me3 / リボソームRNA遺伝子 / SF-KDM2A |
Outline of Annual Research Achievements |
ヒトリボソームRNA遺伝子(rDNA)は約400コピー存在し、その半数がヘテロクロマチン化されているが、H4K20me3が存在するコピーは常に転写抑制されヘテロクロマチン化状態にある。これらからH4K20me3は真のヘテロクロマチンマークと考えられる。我々はこれまでの研究でヒストン脱メチル化酵素KDM2Aの遺伝子から作られる脱メチル化活性のないSF-KDM2AがrDNA転写を上昇すること、rDNA上でH4K20me3を減少することを発見した。しかしH4K20me3の脱メチル化機構、SF-KDM2AのrDNAヘテロクロマチンへの集積機構は不明である。以下に本年度の研究成果を述べる。 1、脱メチル化酵素PHF2の関与の検討:PHF2はH4K20me3脱メチル化活性を持つことが報告されている。PHF2がrDNA 上でH4K20me3脱メチル化に関与することを確認したが、驚いたことにPHF2 KD後もSF-KDM2AによるH4K20me3の減少が観察された。2、PHD fingerの特性の検討:SF-KDM2Aにはメチル化状態を認識してヒストンテールと結合すると予想されるPHD fingerが存在する。このPHD fingerはヒストンテールと結合したが、H3K4me2をもつヒストンテールには結合しなかった。3、CxxC-ZF motif の検討:SF-KDM2Aには非メチルCpGに結合するCxxC-ZF motifが存在する。このドメインを欠いたSF-KDM2AはH4K20me3脱メチル化能、rDNA転写上昇活性を示さなかった。4、核小体に集積のための領域の特定:バイアスをかけずに重要な領域を探すため、SF-KDM2Aが核小体に集積するのに必要な領域を探した。その結果、少なくともSF-KDM2A に4か所の核小体集積と関連する領域があることが明らかになった。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1、今回、SF-KDM2A がH4K20me3を脱メチル化する機構として、脱メチル化酵素の活性化あるいはメチル化酵素の抑制が考えられる。本年度はメチル化酵素PHF2について検討した。この酵素はSF-KDM2A によるH4K20me3減少には関与しないことが明らかになり、この酵素以外の酵素が関わっていることが示唆された。 2、PHD fingerはH3K4me2に結合しないことが明らかになった。H3K4me2をもつrDNA promoterは活性化状態にあることから、この特性はSF-KDM2AがH4K20me3というヘテロクロマチンマークをもつrDNA promoterと相互作用することと関連する可能性がある。 3、非メチルCpGに結合するCxxC-ZF motifがH4K20me3減少に必要であった。このことからSF-KDM2Aが作用するrDNA promoterのクロマチン構造の特徴が明らかになった。 4、SF-KDM2Aには少なくとも4か所の核小体集積と関連する領域が存在することが明らかになった。一つは2・3で述べたSF-KDM2Aのドメインを含んでいるが、他の3か所についての機能は全く不明である。SF-KDM2Aの細胞内局在を決める機構の複雑さが明らかとなった。
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Strategy for Future Research Activity |
1、H4K20me3を脱メチル化する機構の解明。本年はH4K20me3メチル化酵素について検討する。rDNA promoter上にはSuv420h2が存在することが報告されているので、この因子の関与を検討する。 2、SF-KDM2Aが存在するrDNA promoterのクロマチン構造を解明する。CxxC-ZF motifがH4K20me3減少に必要なことは、非メチルCpGとH4K20me3の両方を持つrDNA上でSF-KDM2Aが働くことを示している。非メチルCpGは転写活性化のマークとして、一方H4K20me3はヘテロクロマチンマークとして認識されており、本結果は一見矛盾している。本年はRe-ChIP法などを駆使することにより、SF-KDM2Aが結合しているrDNA promoterのクロマチン構成蛋白質を同定する。 3、核小体集積と関連する領域に結合する因子を同定する。核小体の周りには核膜の様な膜構造は存在せず、その集積は基本的には物質の結合によっている。そこで核小体集積と関連する4か所の領域に結合する因子を探す。本年は特にCxxC-ZFとPHD fingerを含まない領域に注目する。これまでにヘテロクロマチン蛋白質HP1がKDM2Aと相互作用する可能性が示唆されている。本年はSF-KDM2Aの核小体集積についてこの蛋白質等の関与を検討する。
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Causes of Carryover |
次年度は新たな因子としてSuv420h2を取り上げる。そのため、siRNAや抗体など新たに購入する必要が生じた。現在これらについてすでに注文はしているが、まだ製品は届いておらず、次年度に支払いを行わなければならない。そのため、次年度使用額が生じた。
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Expenditure Plan for Carryover Budget |
ヒトSuv420h2をノックダウンするためのsiRNA, 検出のためのRT-PCR primer 抗体等の購入に使用する。
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