2013 Fiscal Year Research-status Report
蛋白質キナーゼROCK―アイソフォーム特異的活性型酵素検出法ならびに阻害剤の開発
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25440091
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
米田 敦子 東京薬科大学, 生命科学部, 助教 (80590372)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ROCK / 蛋白質リン酸化酵素 / 細胞骨格 / 細胞運動 |
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| Research Abstract |
癌悪性化への寄与が示唆されているタンパク質キナーゼROCKには2つのアイソフォームが存在し、病態に関連したROCKアイソフォームの遺伝子やタンパク質レベルでの発現変化の報告が多くなされている。しかし、ROCKの活性は多様な分子機構で制御されていることが解明されつつあり、ROCKアイソフォームの活性状態を測定する方法の開発が必要である。本研究は、細胞内ROCK アイソフォーム活性検出法と阻害剤の開発を目的とする。癌組織でのROCKアイソフォーム特異的機能に関する基礎的知見獲得を通じ、癌悪性度の診断、ROCKアイソフォーム特異的阻害剤の治療応用、標的細胞への阻害剤デリバリーを念頭にした創薬への基盤形成を目指す。平成２５年度はROCKアイソフォーム活性検出ペプチドの作成と、阻害剤としての評価を行った。我々が先に報告した内在性ROCK2阻害剤 Collapsin response mediator protein-2 long form (CRMP2L) 由来のROCK2結合フラグメントをさらに短小化し、当該フラグメントを大腸癌細胞に単独で発現することにより癌細胞の遊走能、浸潤能を抑制できることを見出し、この結果を含む論文（査読付き）を発表した。tag付き ROCKアイソフォーム結合フラグメントを作成し、これを用いて、恒常的活性型ROCKを発現させた細胞において活性型ROCKを検出できることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ROCK2結合フラグメントとして、CRMP２L由来のフラグメントを短小化し、これを浸潤性大腸癌細胞に単独で発現させることにより、癌細胞の遊走、浸潤を全長のCRMP２Lと同程度まで阻害できることを示した。本成果の一部を論文（査読付き）および関連学会において発表した。当該フラグメントを含むROCK結合フラグメントをtag付きで作成した。これらを用いて、恒常的活性型ROCKを発現させた細胞において、活性型ROCKを検出できることを確認した。以上のことより、実施計画と目標は概ね順調に達成できたと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
癌組織を構成する細胞種における活性型ROCKアイソフォームの細胞内局在の解析と特異的ROCK阻害効果を解析する。ROCKの活性は、癌細胞自体の浸潤や増殖への影響のみならず、線維芽細胞による細胞外マトリクス形成、マクロファージによる線維芽細胞活性化因子の分泌、血管形成能に関わる可能性が示されている。上記のような活性化あるいは分化状態になるよう各種細胞を培養し、活性型ROCKの細胞内局在を解析する。また、これまでに同定したフラグメントを細胞に導入し、細胞表現系を解析し、ROCKアイソフォームの活性の重要性を明らかにする。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
比較的安価な試薬を用いる分子生物学実験が多かったため。
上述のように、様々な動物細胞種の培養、遺伝子導入、細胞染色など、細胞生物学、分子生物学、生化学実験に必要な費用を使用する。
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