2015 Fiscal Year Annual Research Report
蛋白質キナーゼROCK―アイソフォーム特異的活性型酵素検出法ならびに阻害剤の開発
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25440091
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
米田 敦子 東京薬科大学, 生命科学部, 助教 (80590372)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 蛋白質リン酸化酵素 / ROCK / 細胞骨格 / 細胞運動 / がん / 細胞外マトリクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質キナーゼROCKは2つのアイソフォームが存在し、癌の悪性化に伴うROCKアイソフォームの発現変化の報告が多くなされている。しかし、ROCKアイソフォーム各々に多くの内在性阻害因子が存在するため、ROCKの発現量は必ずしも活性を反映しない。また、ROCKは癌組織を構成する種々の細胞で機能をもつことが示唆されており、ROCKアイソフォームの活性状態を１細胞レベルで測定する方法の開発が待たれてきた。本研究は、細胞内ROCK アイソフォーム活性検出法と阻害剤の開発を目的とした。先に我々が見出した内在性ROCK2阻害因子Collapsin response mediator protein-2 long form (CRMP2L) 由来のROCK2結合フラグメントをさらに短小化し、当該フラグメントを大腸癌細胞に単独で発現することにより癌細胞の遊走能、浸潤能を抑制できることを見出した。tag付き ROCKアイソフォーム結合フラグメントを作成し、恒常的活性型ROCKを発現させた細胞において、活性型ROCKを検出できることを確認した。ROCK結合フラグメントを大量に大腸菌で発現する条件および精製する系を確立した。線維芽細胞は、液性因子の分泌や細胞外マトリクス形成などを介して、癌細胞の増殖生存や移動能に影響する。癌細胞と共培養することで癌細胞の増殖生存に与える線維芽細胞の影響を評価する系、細胞外マトリクス量の測定法を構築した。これを用い、ROCKの上流因子を調節することで、癌細胞の増殖を阻害できることを示す結果を得た。これらフラグメントを線維芽細胞や各種癌細胞に導入し、特異的ROCK阻害効果の解析を進めた。本成果の一部を関連学会においてポスター（国内）および口頭（国際）発表し、論文（査読付き）と総説（査読付き）を発表した。
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