極性上皮細胞における微小管の編成機構とその役割

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25440094
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 戸谷 美夏 独立行政法人理化学研究所, 発生・再生科学総合研究センター, 研究員 (80455360)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 極性上皮細胞 / 微小管編成 / 微小管マイナス端 / Nezha/CAMSAP3 / ノックアウトマウス / 小腸 / Caco-2細胞 / 三次元培養系

Research Abstract

極性をもつ上皮細胞では、微小管は、表層面―基底面に対して垂直方向に編成され、微小管の動的なプラス端が基底面に、より静的なマイナス端が表層面に向くと考えられている。この特徴的な微小管編成は、極性上皮細胞が生体内で正しく機能するために重要な役割を果たすと考えられているが、微小管編成形成のしくみとその役割については、未だ多くのことが明らかにされていない。本研究では、極性をもつ上皮細胞として腸の上皮細胞に着目し、極性上皮細胞における微小管マイナス端の制御機構と特徴的な微小管編成のしくみ、その生理的役割についての理解を深めることを目指す。非中心体微小管マイナス端に結合するNezha/CAMSAP3の役割とその機構について、Nezhaノックアウトマウスと、ヒト大腸癌由来Caco-2細胞の三次元培養系を用いた解析を行っている。平成２５年度は、１.Nezhaノックアウトマウスの小腸上皮細胞における表現型の解析と、２.ヒト上皮由来Caco-2細胞の三次元培養系を用いた解析を併行して行い、それぞれの解析から以下の結果を得た。
1 Nezhaは、細胞表層面の細胞膜直下(sub-apical region)に、微小管端と共に点状に局在した。Nezha ノックアウトマウスでは、細胞表層面直下に微小管端が認められず、表層に近い領域で微小管の配向が乱れる様子が観察された。このことから、極性上皮細胞における微小管の構築には、微小管マイナス端がNezha依存的に表層面の細胞膜直下に局在することが必須であると考えられた。
2 Caco-2細胞を用いた三次元培養系において、NezhaのRNAiを行った結果、細胞の高さが低くなり、核の位置が表層面と近くなるという、小腸上皮細胞における表現型とよく似た表現型を示した。Nezhaの極性上皮細胞における役割の分子機構について、この系を用いての実験が可能であることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

組織サンプルにおいては、これまで細胞内微小管を鮮明に観察することは困難であった。試料調整法に改良を加えることにより、小腸上皮細胞内の微小管について、より詳細な観察を行うことが可能となり、Nezha/CAMSAP3ノックアウトマウス小腸上皮で細胞内微小管に関する表現型が明らかになった。Caco-2細胞の三次元培養系においては、Nezha/CAMSAP3 RNAiで、生体内で観察されるのとよく似た表現型を示すことが確認できた。この系を用いて、分子レベルでの解析を進めることができると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

小腸上皮細胞については、ひきつづき、細胞極性、膜輸送、細胞内小器官のマーカーとなるタンパク質の局在を調べることから、Nezha/CAMSAP3が関わる微小管編成が関与する細胞機能の考察を進める。Caco-2細胞三次元培養系では、Nezha/CAMSAP3の分子機能や局在の機構を明らかにする実験を行い、極性上皮細胞における微小管編成機序の解析を進める。