2015 Fiscal Year Annual Research Report
初期発生においてERK/MAPKが時期特異的に及ぼす影響の解析
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25440103
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
黒田 裕樹 慶應義塾大学, 環境情報学部, 准教授 (70402229)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ERK / FGF / MAPK / MEK / アフリカツメガエル / 初期発生 / MBT / hsp |
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| Outline of Annual Research Achievements |
初期発生過程におい、FGFシグナルもしくはその下流因子であるERKの活性化は神経化、後方化、中胚葉形成、細胞分裂の停止などを引き起こすという報告がある。本研究は、初期発生において多くのアウトプットが出る原因は、時期特異的にERKの働き方が刻々と変化するという仮説をたて、それを立証するために行われた。
初年度は、立証するためのコンストラクトの構築、実験条件の検証を行った。期待していた手法のひとつである、Rapamycinを用いたアッセイには失敗したが、CMVプロモーターに結合させた常時活性型MEK(caMEK)のDNAの注入によって、Xenopus胚の転写活性時期(MBT)以前にERKをリン酸化させること、ならびにmRNAの注入によってMBT以降のみにERKをリン酸化させることには成功した。また、mRNAを電気的に胞胚期以降に注入する手法についても確立することができた。
二年目も再び実験手法の確立を続けた。次に検討したのはヒートショックプローモーター(hsp)の応用である。hspの後方にcaMEKを組み込み、胚をヒートショックした。lethalな影響が出ることに難儀したが、副作用がでない条件を見つけることに成功した。
最終年度は、これまでに蓄積された手法を用いて、表現型への影響を一通り測定することにした。その結果、MBT以前は細胞分裂の停止、MBT以降には後方化という表現型が確実に得られることがが再確認された。さらに、MBT直後にヒートショックした際に背側化の一環と見られる二次軸の形成が認められるという予期せぬ結果も得られた。
当初の目的は達成できたと言えよう。特にヒートショックアッセイについては、ノックインすることによって、成体での活用も可能となるだろう。作成されたコンストラクトも細胞生物学実験にも応用可能なものであり、今後、様々な方面で利用されるであろう。
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