2015 Fiscal Year Research-status Report
ヤマトヒメミミズ再生幹細胞に発現する遺伝子grimpのタンパク質機能解析
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25440116
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
野呂 知加子 日本大学, 生産工学部, 教授 (80311356)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 再生幹細胞 / 幹細胞増殖 / タンパク質機能解析 / ヤマトヒメミミズ / 無性生殖 / 細胞接着 / 遺伝子発現 / 抗体作成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、砕片分離と再生による無性生殖を行うヤマトヒメミミズEnchytraeus japonensisにおいて、再生初期に再生芽先端付近および中胚葉系列幹細胞に発現する新規遺伝子grimpに着目し、タンパク質レベルでその性質と機能を明らかにすることを目的とする。また、grimpタンパク質と相互作用するタンパク質、およびgrimp遺伝子の影響下にある他の遺伝子との関係を調べることで、再生開始機構および再生幹細胞の実態について解明をめざす。これまでにRNAiによるgrimp遺伝子の発現抑制が再生を阻害することを明らかにしているが、さらに直接的にgrimpの再生における役割を証明するために、タンパク質レベルの機能解析を行う。
平成27年度は､前年度に行った組換え大腸菌のIPTGによるタンパク質発現誘導、および金属カラムによるアフィニティ精製とゲル電気泳動による分離を行って集めたHisタグつきgrimpタンパク質を用いて、業務委託によりポリクローナル抗体（ウサギ）抗体作成を行った。この他に、grimpの予想アミノ酸配列より、適切な箇所2カ所を選んでペプチド合成をし、これにキャリアをつけてウサギに免疫したポリクローナル抗体も作成した。納品された抗体を用いて、ドットブロットにより、精製タンパク質に対する抗体が作成されたことを確かめた。ウェスタンブロットにより、抗体の標的タンパク質のサイズを確認している。
一方、grimp-GFP（N端およびC端）融合ベクターを作成し、ヒト肝臓上皮がん細胞株HepG2に強制発現させ、生成した融合タンパク質を電気泳動で分離後、抗GFP抗体によるウェスタンブロッティングにより確認した。このタンパク質についても精製を行い、ミミズの再生芽に注入してその挙動を観察している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成27年度は夏期に3ヶ月、大学の海外派遣研究員（公務出張）により英国に滞在した。ヤマトヒメミミズを国外に持ち出すことはできないことから、英国滞在時の研究テーマは本テーマと異なるほ乳類の筋肉再生幹細胞と疾患（筋ジストロフィー）に関するテーマであった。その期間分若干遅れが生じたため、抗体作成は完了したが、その後の詳細な解析がまだできていない。平成28年度に引き続き実施する。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は引き続き、Hisタグつきgrimpタンパク質およびgrimpの予想アミノ酸配列ペプチドに対するポリクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロットにより、抗体の標的タンパク質を解析する。また、免疫沈降によりgrimpタンパク質と結合するタンパク質の解析を行う。抗体を利用したgrimpタンパク質の組織中の局在確認および機能阻害実験を行う。また、grimp-GFP（N端およびC端）融合タンパク質を精製し、ミミズの再生芽に注入してその挙動を観察する。
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| Causes of Carryover |
抗体作成用精製タンパク質を材料として、業務委託により抗体作成を行った。これからその抗体を利用してタンパク質機能解析を行う。夏期に3ヶ月大学の海外派遣研修（公務出張）により英国に滞在した。その期間分研究が遅れたため、次年度使用となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
タンパク質機能解析の費用として使用する。
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[Journal Article] Short-term feeding at the wrong time is sufficient to desynchronize peripheral clocks and induce obesity with hyperphagia, physical inactivity and metabolic disorders in mice2016
Author(s)
Yasumoto Y, Hashimoto C, Nakao R, Yamazaki H, Hiroyama H, Nemoto T, Yamamoto S, Sakurai M, Oike H, Wada N, Yoshida-Noro C, Oishi K
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Journal Title
Metabolism
Volume: 65
Pages: 714-727
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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