2014 Fiscal Year Research-status Report
高等植物の小胞体ストレス耐性に関わるGタンパク質及びPLCシグナル伝達系の解明
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25440123
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| Research Institution | Muroran Institute of Technology |
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Principal Investigator |
金原 和江 室蘭工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 客員准教授 (30587746)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩佐 達郎 室蘭工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (00133926)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 小胞体 / ストレス応答 / Gタンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成２６年度は、下記に示す本研究の基礎データとなった未発表結果、及び平成２５年度の成果内容を追確認し、論文としてまとめた。現在、“Arabidopsis AtPLC2 is a primary phosphoinositide-specific phospholipase C in the phosphoinositide metabolism and endoplasmic reticulum stress response”が PLOS Geneticsにて査読中である。
１）９つのAtPLCアイソフォームのうち、plc2変異植物体に根の発育欠損があることを明らかにした。AtPLC2を遺伝学的に相補した植物体では根の発育が回復することを確認し、発育欠損がAtPLC2欠失によるものであることを示した。
２）N-glycosylationの阻害剤であるツニカマイシンで芽生えを処理することにより、小胞体ストレス耐性について調べた結果、plc2変異植物体では、野生型と比較して感受性が上昇し、小胞体ストレスに対して脆弱であることを見出した。この結果を小胞体ストレスマーカー遺伝子の発現を指標にして、定量的リアルタイムPCR法によって検証した。
３）組織及び細胞内特異的なAtPLC２タンパク質の発現を同定する目的で、ProPLC2::PLC2-GUS及びProPLC2::PLC2-Venus形質転換植物体を構築し、それらの発現パターンを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
２年目であった平成２６年度は、これまでの実験結果をまとめ、論文投稿段階まで到達したため順調に進展していると言える。さらに、小胞体に局在しN-glycosylationの初段階に必要な酵素であるArabidopsis Dolichol Kinase 1 (DOK1) の機能解析を AtPLC2と同様におこなうことで、その役割を明らかにした。よって全体としては、当初の計画以上に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の目的及び計画は、高等植物の小胞体ストレス耐性に関わるGタンパク質及びPLCシグナル伝達系を解明するため、３年間で具体的に５項目に関して検証することであった。本年度はその最終年度にあたるが、これまで３項目に関して検証を終えている。本年度は、三量体Gタンパク質の特にベータサブユニットをコードするAGB1遺伝子に注目し、その機能を小胞体ストレス耐性に関わる観点から明らかにする。具体的に下記の実験を遂行し、問題を検証する。
１）AGB1が小胞体ストレス耐性に関わることが報告されているが、その結果に異論がある。AGB1が小胞体ストレス応答にどのように関わるか、agb1変異植物体の芽生えをツニカマイシンで処理すること及び、小胞体ストレスマーカー遺伝子の発現を指標にして、定量的リアルタイムPCR法を用いて検証する。Gα及びGγサブユニットに関してもT-DNA挿入形質転換植物の種を入手して 検証する。
２）AGB1タンパク質の細胞内局在を明らかにするため、ProAGB1:AGB1-Venus形質転換植物体を構築し、細胞内局在を同定する。AtPLC2タンパク質と同様の局在を示すかどうか、また小胞体ストレスに応答して局在が変化するかなど、AGB1及びAtPLC2タンパク質の挙動を明らかにする。
３）AtPLC2とAGB1タンパク質が植物体内で実際に相互作用するかどうかについて、プルダウンアッセイを遂行することで、生化学的に検証する。また、AtPLC2とAGB1タンパク質のそれぞれに結合するタンパク質を、ノンバイアスな方法で同定する。
４）AtDOK1の細胞内局在をProDOK1:DOK1-Venus形質転換植物体を構築して同定する。さらに、dok1変異植物体内におけるN-glycosylation欠損の有無を検証する。
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| Causes of Carryover |
出席予定であった学会に参加できなかったこと、及び消耗品の消費が予想より下回ったため次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度は、７月に開催されるASPBに出席し、また研究打ち合わせを複数回計画している。物品に関しては、計画中の生化学的実験に主に使用予定である。
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