CDPKを利用した植物Ca2+情報伝達網の追跡及びキナーゼ基質特異性変更への挑戦

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25440126
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 石田 さらみ 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (20282725)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: タンパク質キナーゼ / リン酸化 / 基質特異性 / 情報伝達

Outline of Annual Research Achievements

キナーゼ基質特異性変更による新規情報伝達系の創出に向けて、我々がジベレリンフィードバック情報伝達系の解析において同定した植物特有のCDPK1を用いた研究を進めている。C-キナーゼを持たない植物において、CDPK1はカルシウム情報伝達の中核を為すタンパク質キナーゼである。我々は、リン酸化触媒活性と基質認識部位が分離できるCDPK1を情報伝達の中核を担うキナーゼの基質特異性変更の実験基盤確立のための標的とし、解析を進めている。
CDPK1活性化を評価する指標として、これまでは in-gelキナーゼアッセイ、in vitroキナーゼアッセイ等を用いてきた。しかしながら、これらの手法では細胞を破砕し、総タンパク質を抽出した後にキナーゼ活性を評価する事になる。CDPK1活性をリアルタイムに追跡するためには、in vivoでの活性測定が望ましいと考えた。
そこで、キナーゼの活性を蛍光タンパク質を利用した人工的なin vivoレポーター分子で測る手法の確立に着手した。この手法では、分離した蛍光タンパク質のドメインとCDPK1によってリン酸化される転写活性化因子RSGのリン酸化ドメインからなるレポーターを用いる。RSGのリン酸化ドメインがCDPK1によりリン酸化されると、分離された蛍光タンパク質の立体構造が再構成され、対応する励起光により特異的な蛍光を放射する様にレポーター分子を構築する。この手法は、これまでに動物のMAPKファミリーに属するキナーゼで成功が報告されている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

N末端ドメインとC末端ドメインに分割した蛍光タンパク質とRSGのリン酸化ドメインとの繋ぎ部分のバリエーションを様々試しているが、in vivoリン酸化レポーターの作製に手間取っている。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、リン酸化レポータータンパク質の作製を進め、in vivoでCDPK1活性をリアルタイムに可視化する手法の確立を試みる。

Causes of Carryover

リン酸化レポータータンパク質の作製に手間取っているため、次の過程に進む事が出来なかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

リン酸化レポータータンパク質の作製を速やかに完成させ、CDPK1活性の可視化を実現する。
リン酸化レポータータンパク質、、基質特異性を変更したキナーゼを形質転換植物で発現させ情報伝達の流れを操作した個体の作製に進む。