2015 Fiscal Year Research-status Report
SUMOによる紡錘体チェックポイント制御機構の解析
| Project/Area Number |
25440134
|
|---|
| Research Institution | Kumamoto University |
|---|
Principal Investigator |
石田 喬志 熊本大学, 自然科学研究科, 特任助教 (00462656)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | チェックポイントタンパク質 / シロイヌナズナ / 細胞周期 / SUMO |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
細胞分裂を制御する分子メカニズムは非常に複雑であるが厳密である。本研究では植物細胞の染色体分離制御に着目し、チェックポイントタンパク質に対するSUMO翻訳後修飾の関わりを解明し、詳細な分子機構を明らかとすることを目的に研究を行った。
本研究でチェックポイントタンパク質の一つとして着目したシロイヌナズナのオーロラキナーゼ3（AUR3）にはこれまで突然変異体の報告がされていない。そのため、artificial microRNAによるノックダウン系統を作製しており、複数の系統で生長の遅延と形態異常が観察されていた。本年度はCRISPR/Cas9システムによるジーンターゲッティングに取り組んだ。AUR3遺伝子のコード領域を標的としてgRNAを設計し、Cas9配列と共に発現ベクターを作製してシロイヌナズナ野生株に形質転換した系統の育成を行った。T1植物におけるCAPS法とシークエンシングによるGenotypingで標的部位に変異が導入されていることを確認した。これらの系統をさらに育成し、後代において単一の変異を持つ系統を複数取得した。このとき、トランスジーンを持たないnull-segregantを選抜し、今後の研究における柔軟性を確保した。
AUR3は紡錘体の制御に関わる分子であり初期発生にも重要であることから、機能を完全に欠失した突然変異体では胚性致死になる可能性がある。そのため、ヘテロ接合体を優先的に選抜し、T3系統を得た。興味深いことに、得られた複数のアリルで表現型が異なる様子が観察された。
さらに、これらの変異体とゲノム配列を用いた相補性試験を行うため、T3ヘテロ変異体系統とGFP融合タンパク質発現コンストラクトによる形質転換体とを交配し、系統育成に取り掛かった。この系統育成には野生型AUR3と、SUMO-null型AUR3を用いてそれぞれCRISPR/Cas9による複数の変異体候補と交配した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画とほぼ相違ないペースで相補実験が進んでいる。artificial microRNAによるノックダウン系統の作製と確立、相補コンストラクトによる機能検証を終了し、機能的なゲノム配列を確定させている。また、この配列を用いてGFP融合タンパク質発現コンストラクトを作製し、その観察も行っている。さらに、いくつかのDNA損傷試験を行い、その作用を確認することができている。
前年度より新たに着手した、ゲノム編集による機能欠失変異体の作出の取り組みを進め、複数の候補系統作出に至っている。今後はこれらの系統を用いて、artificial microRNA系統と同様の研究を行うことで、当初計画よりも証明能力が高いデータを取得できるものと考えている。延長された研究期間で追加実験を行い、論文として発表する計画である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
前年度までのartificial microRNAによるノックダウン系統を用いた研究成果より、研究対象としたAUR3の局在に関してはSUMO化の有無による影響は無いか、大きくないことが推定された。今後はCRISPR/Cas9システムによる機能欠失変異体でも同様の結果が得られるかを検証し、その証明能力を高める計画である。
前年度より開始したCRISPR/Cas9システムによる機能欠失変異体の作製はおおむね順調に進んでおり、次年度にはホモ変異体を獲得することができると考えている。本研究で標的とする分子の機能欠失変異体には胚性致死や矮化といった表現型が予想される。主に可視的な表現型に注目し、分離率や成長度合いなどのパラメータを定量的に取得する。これらの解析を通じて、植物の発生のどのような段階で個々の細胞周期の制御が重要となっているかを明らかにしたいと考えている。
顕微鏡観察手法や生化学実験・培養細胞を用いた実験手法など、現時点で順調に進んでいるものであっても今後何らかのアクシデントが生じた場合の対応策として共同研究者・研究協力者と適宜協議・議論を行い進めていきたいと考えている。
|
| Causes of Carryover |
本年度はおおむね順調に研究を進めることができたと考えているが、より高レベルの成果を得るために科学研究費助成事業（学術研究助成基金助成金）補助事業期間延長承認申請書を提出し、認められたため期間延長する。
AUR3機能欠失変異体の観察を実施する計画である。aur3突然変異体は存在しなかったため、ノックダウン個体で代用する計画であった。しかし、期間中にCRISPR/Cas9システムによるゲノム編集法を習得し、AUR3遺伝子に関してもヘテロ変異体を作出するに至っている。次年度にはホモ変異体の表現型観察が可能になると予想され、これにより当初計画よりも完成度が高い結果が得られるものと考えている。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験機器や試薬・消耗品など本研究専用に使用することで研究の推進が図れるものに関しては、随時購入する。特に本年度作出したゲノム編集による機能欠失型変異体解析のため、形質転換植物体を育成する技術補佐員を雇用する予定である。主にAUR3遺伝子の機能欠損変異体の作製と観察を行うため、遺伝型検証用のPCR試薬や顕微鏡観察に必要となる消耗品を支出する計画である。その他、プラスチック消耗品および植物育成用土を購入する。
|
Research Products
(14 results)
-
-
[Journal Article] BAM 1 and RECEPTOR-LIKE PROTEIN KINASE 2 constitute a signaling pathway and modulate CLE peptide-triggered growth inhibition in Arabidopsis root.2015
Author(s)
Shimizu N, Ishida T, Yamada M, Shigenobu S, Tabata R, Kinoshita A, Yamaguchi K, Hasebe M, Mitsumasu K, Sawa S,
-
Journal Title
New phytologist
Volume: 208
Pages: 1104-1113
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
-
[Journal Article] Transcriptional repression by MYB3R proteins regulates plant organ growth.2015
Author(s)
Kobayashi K, Suzuki T, Iwata E, Nakamichi N, Suzuki T, Chen P, Ohtani M, Ishida T, Hosoya H, Müller S, Leviczky T, Pettkó-Szandtner A, Darula Z, Iwamoto A, Nomoto M, Tada Y, Higashiyama T, Demura T, Doonan JH, Hauser MT, Sugimoto K, Umeda M, Magyar Z, Bögre L, Ito M
-
Journal Title
EMBO Journal
Volume: 34
Pages: 1992-2007
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
[Presentation] ゼニゴケ初期胚発生を制御する因子の探索2015
Author(s)
丹羽優喜, 酒井友希, 石田喬志, 西浜竜一, 石崎公庸, 大和勝幸, 澤進一郎, 河内孝之, 荒木崇
Organizer
日本植物学会第79回大会
Place of Presentation
朱鷺メッセ：新潟コンベンションセンター
Year and Date
2015-09-07 – 2015-09-08
