2014 Fiscal Year Research-status Report

植物におけるUDP-N-アセチルグルコサミン生合成の生理的意義

Research Project

Project/Area Number	25440139
Research Institution	Ehime University
Principal Investigator	佐藤康愛媛大学, 理工学研究科, 准教授 (80274306)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	シロイヌナズナ / lig変異体 / UDP-N-アセチルグルコサミン / 小胞体ストレス応答 / リグニン化 / GlcNAcキナーゼ / タンパク質糖鎖修飾 / 温度感受性変異体
Outline of Annual Research Achievements	UDP-N-アセチルグルコサミン(UDP-GlcNAc)は植物のN型糖鎖合成等に必須であるが、発生、成長におけるUDP-GlcNAc生合成の生理的意義は明らかではない。本研究では、シロイヌナズナにおいてUDP-GlcNAc生合成が阻害されるlig変異体や、UDP-GlcNAc再生に関わると考えられるGlcNAcキナーゼ(GNK)遺伝子の破壊変異体等を利用し、(1)UDP-GlcNAc欠乏が植物体に与える影響の解析、及び(2)植物におけるGlcNAcからUDP-GlcNAcへの再生経路の解明について研究を進めている。 (1)に関しては、小胞体ストレス応答(UPR)関連遺伝子BiP3プロモーター::GUS導入lig変異体を作成した。BiP3プロモーター::GUS導入lig変異体では、28℃処理によりUDP-GlcNAcが欠乏すると、根端においてUPRが、リグニン異常蓄積部位より広い範囲で起こり、UPRとリグニン蓄積の関連性が示された。また、UDP-GlcNAc欠乏と細胞分裂活性との関係を解析するためCYCB1プロモーター::GUS遺伝子導入lig変異体を作成した。 (2)に関しては、T-DNA挿入GNK遺伝子破壊系統の解析を進めた。GNK破壊系統では、UDP-GlcNAc含量が著しく低下し、GlcNAcを外から与えた場合もUDP-GlcNAc含量が増加せず、GNKがGlcNAc再生の主経路であることが示された。また、lig変異体とGNK遺伝子破壊系統の二重変異体の作成を進ている。一方、UDP-GlcNAc新規合成・再生経路のより詳細な解析のため、エチルメタンスルフォン酸処理により変異導入したlig変異M2系統中から、外生GlcNAcを利用できない変異体を選抜し、複数系統を得た。これらの系統は、UDP-GlcNAcを新規合成・再生できない変異体として、今後の詳細な解析に用いることができる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 2014年度は、lig変異体へのBiP3プロモーター::GUS導入体の作成が完了し、UPR部位とリグニン蓄積部位の関連性が示唆された。また、植物においてGlcNAcからのUDP-GlcNAc再生に関わると推定されるGNK遺伝子を破壊したgnk変異体において、UDP-GlcNAc含量が著しく低下していることを示し、GNKがGlcNAc再生に主要な役割を果たしていることを示した。しかしながら、UDP-GlcNAc生合成の生理的意義の解明に重要な役割を果たすlig/gnk二重変異体を得るのは難しく作業を進行中である。一方、外生GlcNAcを利用できないlig変異M2系統を選抜し多数得ることができ、今後、UDP-GlcNAc新規合成及び再生経路の詳細な解明に用いることができると考えられる。また、これらの変異体は、高温下でUDP-GlcNAc新規合成・再生の両方が阻害される変異体としても利用可能であると考えられる。これらを踏まえUDP-GlcNAcの新規合成・再生の両方を阻害したときの植物体への影響の解析は今後行っていく予定であり、達成度は「やや遅れている」とした。
Strategy for Future Research Activity	2015年度は本研究計画の最終年度であり、BiP3プロモーター::GUS導入lig系統に加え、CYCB1プロモーター::GUS導入lig系統、リグニンモノマー生成関連CCR2プロモーター::GUS遺伝子導入系統等を用い、UDP-GlcNAcが欠乏した際の、植物体の特に根への影響を、UPR、リグニン異常蓄積に注目し、時間的・空間的に詳細に解析し、明らかにしていく予定である。また、UPR抑制変異体(ire1a/1b)等の結果も踏まえ、UDP-GlcNAc欠乏が、どのような機構を介しリグニン異常蓄積を引き起こすのかを総合的に考察する。一方、GlcNAc再生に関わるGNKについては、GNKプロモーター::GUS導入体を作成し、GNK発現部位を明らかにすると共に、lig/gnk二重変異体またはGlcNAcを利用できないlig-M2変異体を用い、UDP-GlcNAcの新規合成及びGlcNAcからの再生の両経路が阻害された場合の影響の解析を、UDP-GlcNAc定量及び植物の発生・成長への影響等の表現型解析を行うことで詳細に進め、UDP-GlcNAc生合成の生理的意義を明らかにしていく予定である。
Causes of Carryover	年度内に研究成果投稿料として100,000円を予定していたが、年度中に論文出版に至らなかったため、翌年度に繰り越すこととした。また、年度末の1～3月に消耗品費を購入するのに必要な予算を残していたが、使い切ることにはならなっかったため、翌年度に消耗品を購入することとした。
Expenditure Plan for Carryover Budget	前年度から繰り越した研究成果投稿料はH27年度に論文出版に使用予定であり、消耗品費はH27年度に使用予定である。今年度分の助成金は、研究遂行のための物品費と研究成果投稿料として主に使用し、必要に応じて、旅費及び謝金として用いる予定である。