2014 Fiscal Year Research-status Report
シロイヌナズナの組織培養における側根原基から茎頂メリステムへの転換機構
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25440143
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| Research Institution | Chubu University |
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Principal Investigator |
坂野 弘美 中部大学, 応用生物学部, 教授 (80340206)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 研三 中部大学, 応用生物学部, 教授 (80164292)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | シュート再生 / ESR1 / 転写制御因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、シロイヌナズナ転写制御因子ESRの機能解析を通して、組織培養において側根原基から茎頂メリステムに転換する分子機構を解明することを目的としている。
１．ESR1プロモータ-ルシフェラーゼ(LUC)融合遺伝子を組み込んだシロイヌナズナの培養組織にアクティベーションタギングベクターを形質転換し、LUC活性が上昇したカルスのスクリーニングを行っている。その結果、これまでに、1個のルシフェラーゼ活性が上昇したカルスを得た。このカルスは、サイトカイニンを含まない培地でも緑色を呈しており、ESR1のシグナル伝達系に関わる遺伝子が活性化されている可能性を示唆している。現在、このカルスを培養し、アクティベーションタギングベクターが挿入されているゲノム領域を解析している。
２．これまでの研究から、ESR1とESR2の翻訳産物は酵素的に同等であることが明らかになっているが、DNA結合領域以外では、C末端の短い領域（ESR motif; ESR1のESR motif をEM1、ESR2のESR motifをEM2とする)のみがアミノ酸配列に類似性がみられる。25年度中に同定したEM1結合因子EIC1は、大腸菌で発現させた組換えタンパク質を用いて相互作用を検討したが、ESR1との結合を確認できなかった。そこで新たに、Split-Trp system でEM1に結合する候補群のサブライブラリーを作製し、LexA two-hybrid systemを用いて、サブライブラリーからEM2に結合する因子のスクリーニングを行った。その結果、シロイヌナズナKIWI遺伝子が同定された。このタンパク質は、動物の転写共活性化因子と相同性があり、EM1及びEM2と相互作用して転写制御を行っている可能性が示唆された。現在、組換えタンパク質を用いて、KIWIとESR1あるいは、ESR2の試験管内における相互作用を検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ESR1の高発現を誘導するアクティベーションタギング株を得ることができたが、ゲノムの組み込み位置の同定で、複数箇所の候補が現れてしまい、原因遺伝子の絞り込みに時間がかかっている。
一方、昨年度同定したESR1結合候補遺伝子は、大腸菌で発現させた組換えタンパク質では、試験管内での相互作用が確認されなかったが、新たに機能的に有力な候補であるKIWI遺伝子を同定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ESR1の発現制御因子については、現在、候補株中でのアクティベーションタギングベクターの挿入箇所の同定に全力を挙げている。ゲノム中での挿入箇所が同定できれば、その近傍遺伝子のcDNAを35Sプロモータで強制発現させ、同様な表現型が見られるかどうかで原因遺伝子を同定する。
また、このスクリーニングを続行し、さらに候補株の同定を行う。
KIWI遺伝子については、組換えタンパク質の精製ができており、現在、試験管内でのESR1及びESR2との相互作用を検討している。
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| Causes of Carryover |
消耗品の一部で割引が生じたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
27年度の前半での消耗品購入時に使用する。
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