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2013 Fiscal Year Research-status Report

細菌外膜リポタンパク質が二成分制御系内膜成分へ細胞表層ストレス情報を伝達する機構

Research Project

Project/Area Number 25440176
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Research InstitutionSaitama University

Principal Investigator

原 弘志  埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (00173071)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 松岡 聡  埼玉大学, 理工学研究科, 助教 (90509283)
Project Period (FY) 2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords二成分制御系 / 細胞表層ストレス / 細菌リポタンパク質 / 機能ドメイン構造 / タンンパク質間相互作用
Research Abstract

Rcs 二成分制御系は,細胞質膜(グラム陰性菌内膜)のヒスチジンキナーゼ(HK)RcsCから細胞質のレスポンスレギュレーター(RR)RcsBへのリン酸転移を,内膜のホスフォトランスミッター(HPt)RcsDが仲介する多成分のリン酸リレー系で,腸内細菌の宿主体外排出時・バイオフィルム形成時などに細胞表層に加わるストレスに応答して活性化される.その活性化に,外膜リポタンパク質RcsF が必須である.内膜局在型やペリプラズム遊離型に改変したRcsFが強くRcs系を活性化することを見出し,内膜のRcsC・Dと容易に相互作用できるようになったためと解釈できることから,RcsFがRcsC・Dと直接相互作用して情報を伝達することを示唆する結果と考えている.
ペリプラズムタンパク質であるmaltose-binding protein (MBP)と融合させてペリプラズム遊離型に改変したRcsFから,N末端40残基,C末端5残基をそれぞれ欠失しても,Rcs系活性化能は残ったが,N末端40残基とC末端5残基を同時に欠失させると,活性化能は失われた.
RcsCのペリプラズム突出領域をMBPと融合させたタンパク質(MBP-RcsCperi)を発現させると,細胞表層に欠損を生じるmdoH・tolB変異によるRcs系活性化を抑制した.MBPのシグナル配列にRcsFを融合させたものから,RcsFのN末端付近にあるProline-Rich Region (PRR)を欠失させたもの(MBPss-RcsFdeltaPRR)はRcs系を強く活性化させるが,MBP-RcsCperiの同時発現によって,活性化が抑制された.これらの結果は,MBP-RcsCperiが外膜RcsF或いはMBPss-RcsFdeltaPRRに結合して,その働きをtitrate outしたためと考えられる.RcsCのペリプラズム突出領域のC末端側約2/3をMBPに融合させたタンパク質も同様のtitration効果を示した.ペリプラズム突出領域のC末端側約2/3にRcsFと相互作用するドメインがあると考えられる.

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Rcs二成分制御系について,その活性化に必須の外膜リポタンパク質RcsFとヒスチジンキナーゼ(HK)RcsCの相互作用を,RcsCのペリプラズム突出領域の過剰発現によるRcsFの活性化能のtitrationという形で示唆することができた.また,その相互作用に働くドメインを,RcsFについてはC末端付近に,RcsCについてはペリプラズム突出領域のC末端側約2/3に限定することができた.
一方,RcsFとRcsCの相互作用をより直接に示す試みについては,RcsFの機能に分子内ジスルフィド結合が必要であることがわかったため,細胞質内で相互作用を検出するtwo-hybrid実験は不適切であると考え,細胞質外での相互作用検出法が必要であると判断した.二分割GFP 断片との融合タンパク質間の相互作用を蛍光で検出するBiFC(bimolecular fluorescence complementation)法の適用を検討している.大腸菌ではSec 経路で分泌されたGFP は蛍光を発しないので,融合タンパク質をTAT 経路で分泌させる工夫が必要だと考え,ベクターの構築を始めている.

Strategy for Future Research Activity

rcsC遺伝子をクローン化し,そのペリプラズム突出領域に相当する部分に欠失や挿入変異を導入し,rcsC欠損変異株でRcsCとしての機能を発揮するかどうか調べる.この実験は,RcsCのペリプラズム突出領域中でRcsFと相互作用して情報を受容するドメインを調べる意味において,MBP-RcsCperiによるtitration実験と相補的なものである.
RcsFとRcsCとの相互作用を生化学的に示すために,RcsF・RcsC・RcsDを欠損した細胞で,MBPss-RcsF∆PRRとMBP-RcsCperiを発現させ,ホルムアルデヒドによる架橋を試みる.架橋された複合体の検出には抗RcsF抗血清と抗MBP抗体を用いる(MBPss-RcsFdeltaPRRはMBPのシグナルペプチドしかもたないので抗MBP抗体には反応しない).
TAT経路のシグナル配列を付けた二分割GFPにRcsF∆PRRとRcsCのペリプラズム突出領域を融合させたタンパク質を発現させ,ペリプラズムにおけるBiFC実験を試みる.
RcsC・Dは相似の膜貫通構造をもち,RcsCのC末端のアスパラギン酸を含むレシーバードメイン・RcsDのC末端のヒスチジンを含むホスフォトランスミッタードメイン以外の部分のアミノ酸配列が類似していることから,HKであるRcsCだけでなく,RcsDもRcsFからの情報を受容している可能性が高いと考えている.RcsDについても,クローン化してペリプラズム突出領域に相当する部分に欠失・挿入を導入する実験や,ペリプラズム突出領域をMBPに融合させてtitrationを試みる実験を行なう.RcsDもRcsFと相互作用していることを示唆する結果が得られたら,RcsDのペリプラズム突出領域についてもホルムアルデヒドによる架橋実験やBiFC実験を試みる.

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

当初,極微量分光光度計NanoDrop 2000を購入する予定を立てていた.ところが,実験室面積を半分以下に縮小する必要に迫られ,設置場所が確保できるかどうか不安が生じたために,購入を断念した.
一方,通常の分光光度計が壊れたため,更新を余儀なくされた.
極微量分光光度計NanoDrop 2000の購入を検討する.
一方,PCR用のサーマルサイクラーが壊れ,研究室には旧式のサーマルサイクラーしかないので,更新が必要である.

  • Research Products

    (9 results)

All 2013 Other

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (7 results)

  • [Journal Article] Importance of the proline-rich region for the regulatory function of RcsF, an outer membrane lipoprotein component of the Escherichia coli Rcs signal tranduction system.2013

    • Author(s)
      Mitsuru Umekawa, Hiroyoshi Miyagawa, Daitetsu Kondo, Satoshi Matsuoka, Kouji Matsumoto, and Hiroshi Hara
    • Journal Title

      Microbiology

      Volume: 159 Pages: 1818-1827

    • DOI

      10.1099/mic.0.069328-0

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Induction of extracytoplasmic function sigma factors in Bacillus subtilis cells with defects in lipoteichoic acid synthesis.2013

    • Author(s)
      Michihiro Hashimoto, Takahiro Seki, Satoshi Matsuoka, Hiroshi Hara, Kei Asai, Yoshito Sadaie and Kouji Matsumoto
    • Journal Title

      Microbiology

      Volume: 159 Pages: 23-35

    • DOI

      10.1111/mmi.12457

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 大腸菌Rcsリン酸リレーシグナル伝達系における外膜リポタンパク質RcsFの役割2013

    • Author(s)
      髙野晃、梅川満、宮川宏義、柴康弘、松本幸次、松岡聡、原弘志
    • Organizer
      2013年度国立遺伝学研究所研究会「細菌細胞の増殖と代謝研究会(スイッチング制御)」
    • Place of Presentation
      国立遺伝学研究所,三島
    • Year and Date
      20131129-20131130
  • [Presentation] 大腸菌Rcsシグナル伝達系におけるRcsFとRcsCの相互作用解析2013

    • Author(s)
      高野 晃,松岡 聡,松本 幸次,原 弘志
    • Organizer
      日本遺伝学会第85回大会
    • Place of Presentation
      慶應義塾大学日吉キャンパス,横浜
    • Year and Date
      20130919-20130921
  • [Presentation] Analysis of the role of two amphipatahic α-helices at the COOH-terminus of Bacilllus subtilis MinD.2013

    • Author(s)
      ugo Furukawa, Kazuki Ishikawa, Wakana Matsushima, Nobuaki Karasawa, Erika Wada, Satoshi Matsuoka, Hiroshi Hara, and Kouji Matsumoto
    • Organizer
      FEMS2013 (5th Congress of European Microbiologists)
    • Place of Presentation
      Leipzig, Germany
    • Year and Date
      20130721-20130725
  • [Presentation] Analysis of extracytoplasmic function sigma factors induced in the cells with no lipoteeichoic acid, lucolipid, and with reduced phsphatidylglycerol.2013

    • Author(s)
      Takahiro Seki, Michihro Hashimoto, Ryota Mineshima, Satoshi Matsuoka, Hiroshi Hara, and Kouji Matsumoto
    • Organizer
      FEMS2013 (5th Congress of European Microbiologists)
    • Place of Presentation
      Leipzig, Germany
    • Year and Date
      20130721-20130725
  • [Presentation] Analysis of biological functions of glucolipids in Bacillus subtilis.2013

    • Author(s)
      Satoshi Matsuoka, Ryota Mineshima, Takahiro Seki, Hiroshi Hara, and Kouji Matsumoto
    • Organizer
      7th International Conference on Gram-Positive Microorganisms (17th International Conference on Bacilli)
    • Place of Presentation
      Montecatini Terme, Tuscany, Italy
    • Year and Date
      20130623-20130627
  • [Presentation] 大腸菌RcsCペリプラズム領域の発現によるRcsシグナル伝達系の抑制2013

    • Author(s)
      高野 晃,松岡 聡,原 弘志
    • Organizer
      第10回21世紀大腸菌研究会
    • Place of Presentation
      ラフォーレ修善寺,伊豆
    • Year and Date
      20130620-20130621
  • [Presentation] 大腸菌Rcsシグナル伝達系におけるRcsFとRcsCの相互作用解析

    • Author(s)
      高野 晃,松岡 聡,松本 幸次,原 弘志
    • Organizer
      第12回微生物研究会
    • Place of Presentation
      東京電機大学東京千住キャンパス,東京

URL: 

Published: 2015-05-28  

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