2014 Fiscal Year Research-status Report
コンデンシンIIを介した染色体複製と凝縮の連係メカニズム：脆弱部位を中心に
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25440184
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
小野 教夫 独立行政法人理化学研究所, 平野染色体ダイナミクス研究室, 専任研究員 (20291172)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | コンデンシンII / 染色体脆弱部位 / セントロメア / 分岐型複製中間体 / 相同組換え |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コンデンシンIIはS期から姉妹染色分体の分割を開始することで分裂期染色体の分離に重要な役割を果たす。一方で、染色体脆弱部位は複製ストレス存在下で姉妹染色分体が分割されず断裂しやすい領域であることから、この部位における染色分体の分割・分離にはコンデンシンIIの役割がより重要になるのではないかと考えて研究を進めた。しかし、昨年度の結果からコンデンシンIIの除去は脆弱部位の断裂を促進しないことが分かった。この断裂の形成過程には複数の相同組換え酵素〔ヌクレアーゼ）が必要であり、分岐型複製中間体を断裂として次の細胞周期に持ち越して修復する経路があることが提唱されている。そこで、複製中間体の修復経路にコンデンシンIIが関与している可能性についてRPE-1細胞を用いて検討した。まず、コンデンシンIIと特定のヌクレアーゼを二重に除去すると、分裂中期に達する前にセントロメアが解離し、染色体腕が極度に折れ曲がる特徴的な形態異常が示された。このときセントロメア領域には分離に働くヘリケースや二重鎖切断の指標となるγH2A.Xが増加していた。したがってこの領域ではDNAの損傷に対する修復機構のバランスが崩れ、除去したもの以外のヌクレアーゼが異常に働いている可能性が考えられた。また、コンデンシンIIの除去によって修復に働くヌクレアーゼ間期核内の局在が変化することが示されたことから、S期のコンデンシンII は相同組換えに寄与するヌクレアーゼが適切な場所で働く足場を作る役割があるのではないかと考えられた。これらの結果から、コンデンシンIIはヌクレアーゼによる分岐型複製中間体の修復を構造的に後押しすることで修復を促進して姉妹染色分体の分割と分離に貢献している可能性があると思われ、この働きは染色体脆弱部位よりもセントロメアでより顕在化しやすいことが予想された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の結果から解析の対象とする細胞をRPE-1（ヒト正常細胞）とした。また、コンデンシンIIを除去しても脆弱部位における断裂頻度には大きく影響が無いという結果かが得られたので、今年度は当初の計画（２－a）のアプローチのなかで、断裂に関わる因子（相同組換え酵素とヘリケース）とコンデンシンIIの関係について詳細に検討した。その結果、コンデンシンIIは相同組換えが適切に行われるために必要なのではないかという、新たな仮説を提唱することができた。上記の概要では触れなかったが、実験計画（２-b）では、コヒーシンノックダウン細胞との比較も行い、コンデンシンIIとヌクレアーゼの除去によるセントロメアの解離は、コヒーシンノックダウン細胞で見られる染色体の形態と似ているが腕部の構造は異なることから、コヒーシンの早期離脱によるセントロメアの解離ではないことが示された。以上のように、今年度は当初の実験計画がおおむね順調に遂行されたものと判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画では本年度は、引き続き脆弱部位における断裂の形成におけるコンデンシンIIの役割を明らかにするため、(a)コンデンシンII 除去細胞における染色体異常の解析、(b)細胞周期を通じた CFS の動態とコンデンシン II の局在、(c)コンデンシンII あるいはコヒーシンが異常に活性化した細胞を用いた解析、を計画していた。これまでの結果から、コンデンシンIIは脆弱部位だけでなく、分岐型の複製中間体が生じてその修復のため相同組換えがおこる領域で重要である可能性が高くなった。形態的な異常としては分裂期染色体のセントロメアに顕在化しやすいことも示された。そこで、(a)では脆弱部位で働く２つの機構（dissolutionとresolution）に焦点をあて、これらに含まれる因子(BLMヘリケース, FD2, SXL4, MUS81, GEN1などのヌクレアーゼ)とコンデンシンIIとの関係を、各因子のsiRNAノックダウンを組み合わせて、局在と染色体形態異常のから明らかにすることを目指す。(b)では、分裂後の核内の染色体特にセントロメアの配置、そして次の分裂期までの形態的変化を細胞生物学的に解析し、相同組換えによる修復に失敗した細胞がどのような運命を辿るのかを明らかにしたい。また、S期からコンデンシンIIはクロマチンと結合するが、詳しい領域は未だに不明である。そこでコンデンシンIIの核内における局在も詳細に解析する予定である。(c)では申請書どおり、コヒーシンやコンデンシンIIの活性を量的、質的に変化させるような因子が、これまでに観察された染色体形態異常にどのように影響するのかを解析する。
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