2014 Fiscal Year Research-status Report
原生生物ブレファリズマにおける性フェロモンの機能と種分化に果たす役割
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25440210
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| Research Institution | Nara Women's University |
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Principal Investigator |
春本 晃江 奈良女子大学, 自然科学系, 教授 (80198936)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
洲崎 敏伸 神戸大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (00187692)
飯尾 英夫 大阪市立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (80145771)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 原生生物 / 接合 / 種分化 / 有性生殖 / 性フェロモン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
原生生物繊毛虫ブレファリズマ（Blepharisma）には相補的な接合型Ⅰ型とⅡ型があり、それぞれの接合型が出す性フェロモン（ガモン１とガモン２）がお互いを誘引し、細胞に形態変化をうながし接合対形成へと導く。ガモン１は分子量約3万Daの糖タンパク質で、異種間では基本的にガモン１は作用しないと考えられている。一方、ガモン２はセロトニンに類似したアミノ酸誘導体であり、種を越えて作用すると考えられている。本研究の目的は、①繊毛虫ブレファリズマにおけるこれらの性フェロモンの機能と作用機構を明らかにすることである。ガモン１については、数種のブレファリズマからガモン１遺伝子を単離し、塩基配列を比較したところ、種を境に変異が生じている部位が２箇所あることを見つけた。この２箇所がガモン１の種特異性を決めていると考えられる。また、B. japonicumで糖鎖の構造決定を行った。ガモン２については、生合成経路を解明するために、テトラヒメナのIDO-γ（Indoleamine 2,3-dioxygenase-γ）遺伝子の相同遺伝子を単離することを試みた。また本研究の目的は、②ブレファリズマの種が分化してきた道筋を探ることである。ブレファリズマの株の採集と培養および種の同定を行い、それらの株を用いて、ガモンの接合対誘導作用の解析を行った。また、さまざまな種の18SrRNA遺伝子やヒストン遺伝子等を調べ、ガモン１遺伝子と比較したところ、ガモン１遺伝子の進化速度はヒストン遺伝子に比べて速いことがわかった。さらに多くの遺伝子について調べることにより、ガモン１が種分化に果たしてきた役割を知ることができると考える。また、Megakaryotype IIとIVの間では接合対形成がほとんど起こらないことを明らかにし、異種間の接合をブロックする機構が接合過程に少なくとも2箇所存在することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ブレファリズマにおける性フェロモンの機能と作用機構を明らかにするために、数種のブレファリズマからガモン１遺伝子を単離し、塩基配列を比較したところ、種を境に変異が生じている部位が２箇所あることを見つけた。この２箇所がガモン１の種特異性を決めていると考えられ、受容体への結合部位に関係する可能性が示唆された。また、質量分析によりガモン1の糖鎖構造を調べ、ガモン１には4箇所の糖鎖結合部位のいずれにも糖鎖が結合していること、全部で6種類の糖鎖構造が存在することがわかった。また、ガモン1のN末端はグルタミンで、ガモン1は278アミノ酸残基から成ることが明らかになった。これまでの結果を総合すると、ガモン１の糖鎖は接合誘導活性を保つためには必要であるが、ガモン1の種特異性を決めているとは考えにくいことが示唆された。また、ガモンの受容体についてⅠ型およびⅡ型細胞を用いて局在を調べている。
ブレファリズマの種が分化してきた道筋を探るために、さまざまな株を用いて18SrRNA遺伝子、ヒストンH4遺伝子、COI遺伝子等を単離し、塩基配列を調べてブレファリズマにおける系統樹を作製した。ガモン１遺伝子の進化速度はヒストン遺伝子に比べて速いことがわかった。また、異なるMegakaryotypeに属する株を、それぞれ特異的なガモンで処理して活性化した細胞を混合し、どのような組み合わせで接合対ができるかを調べたところ、MegakaryotypeII とIII、IIとIV間では、異なるMegakaryotype間の接合対はほとんど形成されなかったことから、種間の接合をブロックする機構が接合過程に少なくとも2箇所存在することを明らかにした。しかしMegakaryotypeIIIとIVの間では接合対は比較的高率に形成されたことから、接合対形成の起こりやすさはMegakaryotypeにより差があると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
繊毛虫ブレファリズマにおける性フェロモンの機能と作用機構を明らかにする課題：Blepharisma japonicumではない他の種や他の株のガモン1でも同様に糖鎖の不均一性が見られるのか、また、今回わかったN末端までを含む組換えガモン1の活性を調べること、また酵母や他の発現系を用いてランダムに結合させた糖鎖で接合活性が見られるのかについて検討することなどが今後の課題である。また、5-OH-L-tryptophan（5-HTP)と抗5-HTP抗体を用いたⅠ型細胞におけるガモン2受容体の検出をさらに進め、 5-HTP がガモン2受容体に結合しているかどうかを検証する。ガモン１抗体を用いて、同様にⅡ型細胞におけるガモン１受容体の局在を検証する。さらにガモン1およびガモン2受容体を単離する試みも行う。ガモン2の生合成経路の解明に向けて、さらに遺伝子の単離を進める。また、相手の型のガモンによって活性化された細胞では、どのような形態変化が見られるかを、更に詳しい電子顕微鏡的観察を行って明らかにする。
ブレファリズマの種が分化してきた道筋を探る課題：さらに多くのブレファリズマの株を得て、種の同定を行い、18SrRNA遺伝子、ヒストンH4遺伝子、COI遺伝子、RNAポリメラーゼⅡ遺伝子等を単離し、塩基配列を調べて、ブレファリズマにおけるさらに詳細な系統樹を作製したい。ガモン１遺伝子についても、B. hyalinumから遺伝子を単離し、系統樹を作製したい。また、ガモン1の作用の特異性について再検討し、ガモン１の作用とガモン1のアミノ酸配列との間の相関について、さらに解析を進める。また、MegakaryotypeⅢとⅣの間の異種間の接合対でも核変化が進行するかどうか、また子孫は形成されるかを調べたい。これらの結果をもとに、ブレファリズマの種が分化してきた道筋を考察したい。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じたのは、物品購入の際に不足額が生じないように慎重に支出を行ったためである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額が生じたとはいえ、額はわずかであるので、次年度の物品購入費、学会参加旅費および実験補助者への謝金のいずれかに含めて使用することが可能である。
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Research Products
(4 results)
