2014 Fiscal Year Research-status Report
人工制限酵素を用いた高効率イネ葉緑体ゲノム編集の確立
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25450002
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
刑部 敬史 徳島大学, 農工商連携センター, 特任教授 (70450335)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 葉緑体 / ゲノム編集 / TALEN / CRISPR/CAS9 / 遺伝子ターゲッティング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
葉緑体は二酸化炭素同化をおこなう重要な細胞小器官であり、糖、アミノ酸および脂質代謝に欠かせない場である。また核ゲノムとならび、遺伝子導入を行える重要な標的ゲノムでもある。ところが、葉緑体ゲノムへの遺伝子導入技術は、モデル植物であるタバコを除いて、イネなどの主要農作物については実用化に至っていないのが現状である。そこで、本研究ではゲノム遺伝子を自在に改変するゲノム編集技術を応用し、いまだ汎用的な技術に至らないイネ葉緑体ゲノムへの遺伝子導入法を確立することを目指す。
平成25年度に作製したTALEN発現コンストラクトの遺伝子導入をタバコ葉緑体内において発現させたが、標的近傍における切断を検出することができなかった。あらためてTALENタンパク質の葉緑体以降を確認するため、TALE+GFPレポーターを作製し葉緑体内GFP蛍光の観察をおこなったところ、有意な傾向は認められず、不完全なTALEタンパク質が葉緑体へと移行している可能性も考えられた。
そこで、TALENにかわる人工制限酵素として核ゲノム編集では実績のある、CRISPR/CAS9システムの利用を考え、葉緑体以降シグナルを保持するCAS9ベクターを作製し、葉緑体型CRISPR/CAS9システム構築の整備を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画では人工制限酵素としてTALENを利用する方針で行ってきたが、TALENタンパク質の葉緑体内以降が不確かなため、TALENに変わる人工制限酵素として急遽CRISPR/CAS９システムの利用を考え、葉緑体ゲノム切断を行える実験ツール整備を行ったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
TALENにかわる人工制限酵素として葉緑体移行シグナルを保持するCAS9を利用した葉緑体CRISPR/CAS9システムを整備するため、まずの葉緑体移行シグナル+CAS９＋GFP融合遺伝子をタバコプロトプラストへ導入し、CAS９タンパク質の葉緑体移行を確認する。
葉緑体移行が確認できれば、標的認識分子であるgRNAとともに葉緑体移行シグナル+CAS9をタバコプロトプラストへ導入し葉緑体ゲノム切断の確認を行う。
ついで遺伝子ターゲッティング実験を進め、切断後の野生型 cpDNA の構造変化を解析し、人工制限酵素による切断を行いさらに遺伝子変換を進めるか、切断を行わず薬剤選抜のみにより野生型 cpDNA を排除するか決定する。最終的に組換え型 cpDNA からなるホモプラストミック化の最適な条件を絞り込んでいく。
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| Causes of Carryover |
当初計画していた人工制限酵素の利用が不確かとなったため、実際に計画していた遺伝子ターゲッティング実験およびその結果を精査するジェノタイピング実験に係る試薬の購入を行うことができず、代わりに計画外であった人工制限酵素を作製する試薬に変更したため、その差額として使用に変更が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当初計画していた実験を次年度に行うため、それに必要な試薬を購入する。また次年度は最終年度であり、実験計画の迅速な進行を行うために、遺伝子クローニングおよび塩基配列の確認には受託合成および受託シーケンスの利用を考え、それに充填する。
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