2014 Fiscal Year Research-status Report

TYLCVのゲノム複製における宿主RPA-ウイルス間相互作用の機能解明

Research Project

Project/Area Number	25450065
Research Institution	National Agriculture and Food Research Organization
Principal Investigator	山口博隆独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 野菜茶業研究所野菜育種・ゲノム研究領域, 主任研究員 (30355664)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	トマト黄化葉巻病 / TYLCV / トマト / 宿主因子 / 生物間相互作用
Outline of Annual Research Achievements	（１）SlRPA1遺伝子について改変を行った遺伝子組換えトマト培養細胞系統のTYLCV増殖評価平成25年度に作出したstableな遺伝子組換えトマト培養細胞系統（SlRPA1の過剰発現コンストラクト導入、SlRPA1のRNAiコンストラクト導入、相互作用能欠失変異SlRPA1の過剰発現コンストラクト導入）を供試して、SlRPA1の発現量の増減や、ウイルスタンパク質C3との相互作用の有無がウイルス増殖に与える影響を評価した。TYLCVの接種は感染性クローン（TYLCV-Mld系統、焼津株）を保持したアグロバクテリウムを培養細胞と共存培養・感染させることにより接種した。接種後、経時的にウイルスDNA量をリアルタイムPCRにより定量しウイルス増殖量を評価した。いずれの遺伝子組換え培養細胞系統においても、接種後ウイルスの増殖が観察されたが、導入コンストラクトがウイルス増殖に与える再現性のある影響を認めることはできなかった。（２）SlRPA1遺伝子について改変を行った遺伝子組換えトマトの作出 SlRPA1の発現量の増減およびC3タンパク質との相互作用の有無が植物体内におけるウイルス増殖に与える影響を評価するために、SlRPA1遺伝子について改変を行った遺伝子組換えトマトを作出した。野生型および相互作用欠失変異型のSlRPA1の過剰発現コンストラクトおよびSlRPA1を標的としたRNAiコンストラクトを、アグロバクテリウムを用いたリーフディスク法により罹病性トマト「秋玉」に導入した。野生型SlRPA1の過剰発現コンストラクト、RNAiコンストラクトについて、遺伝子組換え再生シュートを得た。相互作用欠失変異型のSlRPA1の過剰発現コンストラクトについては、現在形質転換体の作出途中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason SlRPA1遺伝子について改変を行った遺伝子組換えトマト培養細胞系統のTYLCV増殖評価については、計画通りの評価を行ったが、期待された導入遺伝子がTYLCV増殖に与える影響を認めることができなかったため、進捗はやや遅れているとした。培養細胞を用いた増殖評価系では、接種後のウイルス増殖量のバラツキが大きく、導入遺伝子の影響を検出することは困難と考えられた。27年度は遺伝子組換えトマトを用いた解析で、導入遺伝子の影響が評価できることを期待している。 SlRPA1遺伝子について改変を行った遺伝子組換えトマトの作出については、SlRPA1の過剰発現コンストラクト、RNAiコンストラクトについては作出済みであるが、相互作用能欠失変異型の過剰発現コンストラクトについては現在作出途中であるため、進捗はやや遅れているとした。相互作用能欠失変異型のコンストラクトについては、カルスの再生効率が悪かったため、形質転換を再度やり直し現在培養中である。27年度には相互作用能欠失変異型の形質転換トマトについてもTYLCVの感染に対する罹病性反応の解析に供試できる見込みである。
Strategy for Future Research Activity	（１）TYLCV感染が進行する細胞におけるSlRPA1およびTYLCVタンパク質C3の動態可視化および相互作用強度定量化野生型および相互作用欠失変異型のSlRPA1とCFP、C3とYFPの融合タンパク質を導入した形質転換培養細胞系統を作出する。形質転換培養細胞系統へのTYLCVの接種は感染性クローンを利用して行う。各融合タンパク質の局在性の変化を共焦点レーザー蛍光顕微鏡下で観察するとともに、CFP-YFP FRETを計測し両タンパク質の相互作用強度を定量化する。（２）SlRPA1遺伝子について改変を行った遺伝子組換えトマトのTYLCV感染に対する罹病性反応の解析 26年度に作出した各種組換えトマトに対してTYLCVを接種し、ウイルス増殖量および病徴発現程度を評価しSlRPA1-C3間相互作用がTYLCVのゲノム複製や罹病性反応に与える影響を明らかにする。