2014 Fiscal Year Research-status Report
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25450077
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
大河 浩 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (70436012)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 葉緑体 / プロトン / 環境応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
葉緑体は光合成、脂質合成など重要な諸反応が行われる場であり、膜を通して様々な物質のやりとりをしているが全容解明には至っていない。本研究は未解明であった葉緑体包膜プロトン輸送に関与する分子実体の1つはCemA2であるかどうかを検証することを目的としている。昨年度の成果からCemA2が葉緑体にターゲットされる事が確かめられたが、葉緑体で機能しているのかどうか不明であった。
そこで、葉緑体におけるプロトン吸収放出反応に関与しているのかどうかを確かめるために、選抜から得られたAtCemA2機能欠損ホモ系統およびコントロール野性個体から無傷葉緑体をそれぞれ単離し、マイクロpH電極を用いて光照射による葉緑体プロトン吸収放出反応測定を行った。無傷葉緑体緩衝液懸濁液を用いたコントロールの単離葉緑体において、光照射後のプロトン放出活性がみられ、一方でAtCemA2機能欠損形質転換体の単離葉緑体においても、放出活性は確認されたが半分程度の活性しか示さなかった。無機炭素添加条件下においても機能欠損形質転換体単離葉緑体のプロトン放出活性能の低下が確認された。光合成電子伝達反応の寄与を確認するために、阻害剤であるDCMU存在下で同様に調べた結果、コントロール葉緑体および機能欠失形質転換体の葉緑体のいずれにおいても、光照射後のプロトン放出活性がみられなくなった。これらのことから、AtCemA2は光照射後の葉緑体プロトン放出能に関与していることが示され、これらの反応は光合成電子伝達反応と連動して起こっていることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
選抜によるAtCemA2機能欠損ホモ系統を得ることができたこと、得られたホモ系統を含めた無傷葉緑体の単離精製および単離された無傷葉緑体での光照射後のプロトン吸収放出活性の検証により、AtCemA2が葉緑体で機能しているタンパク質であり、光照射後の葉緑体プロトン放出能に寄与していることが明らかにすることができたなど重要な知見が得られ、計画通りに進捗している。
また、AtCemA2特異的抗体を作成し抗原ペプチドと反応することは確認することはできたが、単離葉緑体タンパク質を用いたウェスタンブロッティングでバンドの検出はできなかったため今後の検討が必要である。また、窒素同化時における寄与の可能性が発現解析から示唆されたが、植物個体の成長には影響を及ぼしておらず、別の環境要因の可能性について検討する必要がある。これらはポジティブな結果を得られていないが、おおむね計画通り進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の成果からCemA2が光照射後のプロトン吸収放出活性の検証により、AtCemA2が、光照射後の葉緑体プロトン放出能に寄与していることが明らかにすることができたため、次年度はこの葉緑体での反応が植物個体の成長や環境変化にそのような役割があるのか、またどの程度寄与しているのかを検証する。予備的ではあるが、高温時において発現誘導される事が示唆されているため、温度変化による生育への影響についてなどを検討する必要性が出たため、検討する予定である。
また、AtCemA2は一過的発現解析から葉緑体に局在することが示唆されたが、現時点では葉緑体のどこで機能しているのか詳細を証明できた訳ではない。そこで、現在作成選抜を進めているGFPをレポーター遺伝子として発現させた形質転換体を得ることによって、その局在場所が葉緑体外包膜か内包膜もしくはチラコイド膜であるのかを蛍光顕微鏡もしくはGFP抗体を用いた手法で推進していく予定である。
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| Causes of Carryover |
当該年度は計画よりやや進捗した項目と概ね計画通りであるものの、それらの結果により予定していた実験計画の細部の変更等もあった。それらに適切に対応した結果、次年度使用額がややプラスとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額および翌年度分の助成金と合わせて、翌年度の研究計画および当該年度の細部変更に伴う実験計画に沿って消耗品などにあて、適切に使用する計画である。
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Research Products
(3 results)
