2013 Fiscal Year Research-status Report
リボヌクレアーゼを介した成熟リボソーム排除機構の解明
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25450093
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小川 哲弘 東京大学, 農学生命科学研究科, 助教 (40323480)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | リボヌクレアーゼ / リボソーム |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、出芽酵母がストレスに曝された際に、RNase T2ファミリーに属するRny1pがrRNAを分解して、余剰リボソームの排除を分担することを実証し、その分子機構を明らかにすることである。
本年度は、Rny1pによる「rRNA分解を介した成熟リボソーム除去」を実証することを中心に実験を行った。飢餓応答を誘導するラパマイシンを作用させた出芽酵母で、rRNA量が減少することが報告されたが、これにはRny1pによるrRNA分解が関与すると考えた。また、ラパマイシンを作用させた野生株では、生育速度が低下するものの増殖が継続されるのに対し、RNY1破壊株は生育を完全に停止した。このことから、Rny1pは栄養飢餓条件に生育を適応させることが分かった。
このRny1pによる生育適応化に際して、細胞内でRny1p依存的に起こる遺伝子の発現変動を、DNAマイクロアレイを用いて経時的かつ網羅的に解析した。その結果、野生株では、培養を継続するにつれてリボソームの生合成に関わる遺伝子セットの発現が上昇した。一方、こうした発現は、RNY1破壊株では見られなかったことから、Rny1pに依存した現象であると考えられた。これら遺伝子セットから無作為に抽出した遺伝子の発現変動を、リアルタイムPCRを用いて測定した。野生株、破壊株共、これら遺伝子の発現がラパマイシン添加後、急速に低下した。これは、ラパマイシンの作用により新規リボソーム合成が抑制されるためと考えられる。その後、野生株では再び発現が上昇したが、破壊株ではこれが見られず、マイクロアレイの結果が再現された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、研究計画に示した「課題1: Rny1p のrRNA 分解を介した成熟リボソーム除去の実証」「課題2: Rny1p がrRNA を分解する場の特定」の二つの課題を達成目標とした。特に、本年度は「課題1」を中心に行うため、これを「(1)リボソーム分解の定量解析」と「(2)リボソームの動態に与える影響の解析」の小課題に分けて研究を進めた。
「(1)リボソーム分解の定量解析」については、リボソーム量の変動を、rRNA量のレベルで明らかにすることが出来たことから、概ね達成出来たと言える。また、「(2)リボソームの動態に与える影響の解析」として、ストレスを作用させた野生株と破壊株のポリソームレベルを解析することを計画していたが、本年度は実現出来なかった。一方で、当初の予定にはなかったが、DNAマイクロアレイを用いてRny1pの機能が細胞内でどのような影響を示すかを解析した。この結果から、本研究の目的である、Rny1pによるリボソーム排除の分子機構の解明が可能と期待されたため、ポリソーム解析に置き換えて研究を推進している。また、そうした理由から、初年度に購入を予定していた「密度勾配解析装置」の購入はしなかった。
「［課題2］Rny1p がrRNA を分解する場の特定」については、細胞内でタグをつけて発現させたRny1pが検出出来ておらず、実験途上にある。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度、「リボソーム分解の定量解析」が完遂出来なかった理由として、リボソームタンパクに対する適切な抗体が入手出来なかったことが挙げられる。特定のリボソームタンパクにタグを付加し、これに対する抗体を用いる方向で進めていきたい。
「Rny1p がrRNA を分解する場の特定」に関して、本年度中頃にRny1pの細胞内局在について詳細な報告があった。この報告に基づくと、Rny1pが液胞に局在するとする過去の報告が強く支持される。そこで、次年度からはRny1pが液胞内でリボソームを分解するとの想定に立って実験を進める。リボファジーは、液胞内でリボソームが分解される現象として2008年に報告されたが、分子機構等の詳細は明らかにされていない。今後、このリボファジーとの関係についても検証していく。
本年度に行ったDNAマイクロアレイによる解析は、次年度以降に予定する「リボソーム排除機構の遺伝学的解析」に対しても有用な情報を与えると期待される。データをより詳細に検討することで、Rny1pと連携して機能すると考えられる因子の絞り込みを行う予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本年度に予定していた「密度勾配解析装置」の購入を中止したため。
シークエンスの受託解析を含めた「その他」の品目として利用する。
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Research Products
(2 results)
