2014 Fiscal Year Research-status Report
リボヌクレアーゼを介した成熟リボソーム排除機構の解明
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25450093
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小川 哲弘 東京大学, 農学生命科学研究科, 助教 (40323480)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | リボヌクレアーゼ / リボソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、課題1の「Rny1p のrRNA 分解を介した成熟リボソーム除去の実証」、および課題3の「リボソーム排除機構の遺伝学的解析」を中心に研究を進めた。
課題1に関して、昨年度は未達成であった「Rny1pによるrRNAの分解の定量的解析」を行った。野生株およびRNY1破壊株にラパマイシンを作用させた後、経時的に全RNAを調製した。18S, 25S rRNAを逆転写し、リアルタイムPCRを用いてそれぞれのrRNAを定量した。その結果、破壊株において18S, 25S rRNAの蓄積が見られた。このことから、ラパマイシンの作用に応答してRny1pが18S, 25S rRNAを分解する様子が定量的に証明された。更に、リボソーム量を定量するために、特定のリボソームタンパクにエピトープタグを付加した。これを用いてウエスタンブロッティングを行うことで、リボソームタンパク質の検出に成功した。これより、リボソーム量を定量化する実験手法が確立出来た。また、RNY1遺伝子破壊株では、液胞内に核酸の蓄積が観察されることから、液胞内でrRNAが分解されると考えた。
課題3に関して、既知のリボソーム分解系として(1) ユビキチン-プロテアソーム系 (2) 選択的オートファジー（リボファジー）が知られている。本研究で注目するリボソーム分解が、これらの系に依存するかを検討した。 そこで、これらの経路に関与する因子の遺伝子を破壊した株において、Rny1pによるrRNA分解が起こるかを調べた。しかし、いずれの遺伝子を破壊してもrRNAの分解には影響しなかったことから、Rny1pが関与するリボソーム分解は、これら既知の経路とは異なることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、「課題1：Rny1pのrRNA分解を介した成熟リボソーム除去の実証」「課題2：Rny1pがrRNAを分解する場の特定」「課題3：リボソーム排除機構の遺伝学的解析」の三つの課題を設けている。
課題1に関しては、一部計画の修正はあったものの、Rny1pによるrRNA分解が定量的に実証され、更にリボソーム分解を定量的に評価する実験系が確立されたことから、順調に進行していると考える。課題2については、液胞内でrRNAが分解されることが明らかとなったが、一方でRny1pがどのように液胞へ移行するかは不明である。課題3については、Rny1pによるrRNA分解は、既知の経路と異なる新規機構に依存することが示唆されたが、積極的に関与する因子は未同定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度である次年度は、最も進行が遅れている課題3を中心に行う。研究計画で提案した通り、出芽酵母非必須遺伝子破壊株コレクションの中から、Rny1pによるrRNA分解が起こらない株をスクリーニングする。これに基づいてリボソームあるいはRny1pの、液胞への移行に関与する因子を検討する。また、特定の遺伝子に注目して実験を行った結果、rRNA分解に関与すると思われるものがいくつか得られており、更に検証を進める。リボソームタンパクの分解を担うプロテアーゼの同定も行う。そこで、まず液胞プロテアーゼを全て欠損した株において、リボソームタンパク分解が起こらなくなるかを調べる。
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| Causes of Carryover |
試薬購入費が当初予定していた額を若干下回ったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
シークエンスの受託解析を含めた「その他」の品目として利用する。
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Research Products
(2 results)
