麹菌のプロセッシングプロテアーゼの基質となる菌糸分岐制御タンパク質の探索と同定

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25450096
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 山形 洋平 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (40230338)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹内 道雄 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (50092490)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 黄麹菌 / Aspergillus oryzae / proceccing protease / kexin / protein secretion

Outline of Annual Research Achievements

麹菌 Aspergillus oryzae のゴルジ体に存在する唯一と考えられるプロセッシングプロテアーゼである kexin と酵母で kexin と共同作業を行っていると考えられる セリンカルボキシペプチダーゼ KexA の生体内での基質を明らかにするために必要となるツールとなるタンパク質の発現と精製をこころみた。これらのタンパク質には、 pull-down 用の FLAG-tag、精製用の His-tag を付加し、膜貫通領域を欠失させた kexin ならびに、KexA をコードする遺伝子を麹菌用発現ベクター pNGA142 の高発現プロモーターの下流に挿入し、麹菌を宿主として発現を行ったところ活性測定によって目的タンパク質は発現していることが確認できた。両タンパク質は、それぞれカルボキシル末端に FLAG-tag、His-tag の順に結合しているが、麹菌を宿主とした発現系では、これらが欠落していることが明らかとなった。この欠落は、ホスト由来のタンパク質分解酵素の影響であることが考えられた。そこで、新たにこれらの Tag の欠落が生じないようなアミノ酸配列を挿入したタンパク質をを設計した。これらを同様に麹菌の発現系を用いて発現させた。しかし、これらによっても活性を持つタンパク質の生産には成功したものの、精製、検出用の tag を確認することはできなかった。そこで、これらと並行して大腸菌を用いた発現系でのタンパク質の発現を開始した。
一方、麹菌 kexin 破壊株と野生株の間で、解析用サンプルの調製が同じように可能であるかどうかの確認を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は、pull-down assay を行い基質となるタンパク質を明らかにする試験を行っているべきところ、タグ付きタンパク質の精製が遅れているために、全体に遅れが生じている。

Strategy for Future Research Activity

pull-down assay 用のツールとなるタンパク質の発現系を変更し、ツールの作成を行う。これを用いて、pull-down assay を行い、kexin、KexA の基質を探索する。この結果得られたタンパク質を同定する。ついで、この基質となるタンパク質をコードする遺伝子の欠損株を作成し、kexin ならびに KexA の破壊株と同様の変化が生じるかどかを明らかにする。

Causes of Carryover

実験計画が遅れたため、必要な消耗品を購入することができなかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度で計画の遅れを取り戻し、予定通りの実験を行うため支出する予定である。