2014 Fiscal Year Research-status Report
革新的ゲノムシャフリングによる草本木質系原料からの高効率エタノール生産酵母の開発
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25450100
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
杉山 峰崇 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80379130)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原島 俊 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (70116086)
笹野 佑 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (90640194)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Bioethanol / Saccharomyces cerevisiae / Thermoresistance / Xylose fermentation / Genome shuffling |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高温耐性の改良については、昨年度までに構築したゲノムシャフリング株を親株にして、49℃でも旺盛な増殖を示す酵母Hansenula polymorphaのゲノムDNAを用いて2回目のゲノムシャフリングを行なった。1回目のゲノムシャフリング株が生育できない42.5℃でも生育できる高温耐性候補株を取得し、42.5℃条件下で発酵特性を解析したところ、生育、グルコース消費共に2回目のゲノムシャフリング株が優れており、エタノール生産性が1回目のゲノムシャフリング株よりも2倍向上した株を得ることができた。H.polymorphaは出芽酵母に比べてリグノセルロース由来の発酵阻害物質であるバニリンに耐性を示すが、今回得られたゲノムシャフリング株は親株よりもバニリン耐性を示したことから、バニリン耐性についても改良することができた。
リグノセルロース由来の発酵阻害物質であるバニリン、酢酸、乳酸に対して過剰発現で耐性を付与する出芽酵母遺伝子の同定を進めた。酢酸と乳酸に対しては転写因子HAA1を過常発現することで耐性を付与できた。バニリンについては、候補遺伝子を多数取得しており解析を進めている。
キシロース発酵性の改良については、高温耐性出芽酵母株とキシロース発酵性酵母Scheffersomyces stipitisの細胞融合ゲノムシャフリングを行なったが、候補株を得ることができなかった。次に、キシロース発酵性を付与するためにXR-XDH-XK遺伝子カセットを構築して高温耐性出芽酵母株に導入した。しかし、キシロース発酵能力の高い株を得ることはできなかった。そこで、キシロース発酵性酵母Spathaspora passalidarumの高温耐性を改良することを検討した。そのため、S. passalidarumを親株として高温耐性出芽酵母のゲノムDNAを用いてゲノムシャフリングを行なったところ、40℃条件下でもキシロース資化性を示す候補株を数種得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
高温耐性の改良については、42.5℃まで改良することに成功し、エタノール生産性を2倍以上改良することに成功した。今後、さらにゲノムシャフリングを行い高温耐性の改良について検討する。しかし、ゲノムシャフリングによる今以上の高温耐性の改良が難しい場合には、45℃でも良好なエタノール生産性を示す酵母Hansenula polymorphaを親株にして、45℃でのH. polymorphaのキシロース発酵性の改良を目指す。
リグノセルロース由来の発酵阻害物質である酢酸および乳酸に耐性を付与する遺伝子を取得することに成功した。強力な発酵阻害物質であるバニリンに対しても耐性を付与する候補遺伝子を取得できたことから、概ね順調に進んでいる。
キシロース発酵性酵母Scheffersomyces stipitisなどを用いた細胞融合ゲノムシャフリングおよびキシロース資化遺伝子群（XR-XDH-XK遺伝子群）の導入による高温耐性出芽酵母のキシロース発酵性の改良を試みたが、高いキシロース発酵性を示す株を得ることはできなかった。そこで、手法を変更し、高いキシロース発酵性を示すSpathaspora passalidarumを親株にして高温耐性出芽酵母のゲノムDNAを用いてゲノムシャフリングを行なった。その結果、40℃の高温条件下でもキシロース培地で生育可能な候補株を得ることができたことから、この候補株の高温条件下でのエタノール生産性の解析を進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、さらにゲノムシャフリングを行い高温耐性の改良について検討する。一方、ゲノムシャフリングによる今以上の高温耐性の改良が難しい場合には、45℃でも良好なエタノール生産性を示す酵母Hansenula polymorphaを親株にして、45℃でのH. polymorphaのキシロース発酵性の改良を目指す。
強力な発酵阻害物質であるバニリンに対しても耐性を付与する候補遺伝子を取得できたことから、まず、耐性付与遺伝子を同定する。その後、耐性付与遺伝子を用いてバニリンストレス条件下での発酵試験を行い、エタノール生産における耐性付与遺伝子の優位性を示す。
高いキシロース発酵性を示すSpathaspora passalidarumを親株にして、ゲノムシャフリングにより40℃の高温条件下でもキシロース培地で生育可能な候補株を得ることができた。そこで、この候補株の高温条件下でのエタノール生産性の解析やさらなるゲノムシャフリングによる高温耐性化を進める。そして、構築したゲノムシャフリング株やH. polymorphaやS. pastridarumを用いて45℃での高いバイオエタノール生産収率を達成する。
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