2014 Fiscal Year Research-status Report
糸状菌セルロース誘導制御因子 ClbR の作用機序解析
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25450110
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
谷 修治 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 講師 (80405357)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Aspergillus aculeatus / セルラーゼ / 遺伝子発現制御 / ClbR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、糸状菌 Aspergillus aculeatus におけるセルロース系バイオマス分解酵素遺伝子の発現制御機構を分子レベルで解明することを目的とし、本課題では、(1) セルロースやセロビオースに応答して遺伝子の発現を誘導する新規転写活性化因子 cellobiose response regulator (ClbR) の作用機序を解明することを目的として、ClbRの相互作用因子の探索と機能解析、また(2) 新たなセルラーゼ遺伝子発現制御因子のスクリーニング・同定・機能解析 を課題として設定した。
これまでに我々は(1)の解析において、ClbRとパラログ因子ClbR2が、マンナンやセルロースに応答した遺伝子発現を誘導する転写活性化因子ManRの遺伝子発現を協調的に制御していることを遺伝学的に明らかにしてきた。更に、ClbRのパラログ因子ClbR3を高発現させると、セルラーゼやヘミセルラーゼ遺伝子の発現に変動が観察された事、ClbR３は、ManRおよびClbRが制御する遺伝子の発現には関与していないことから、ClbRおよびそのパラログ因子が協調的或いは独立してセルラーゼおよびヘミセルラーゼ遺伝子の発現を制御していることが示唆された。
また(2)の解析においては、我々が構築したセルロース誘導制御因子のポジティブスクリーニング系を用いて探索した結果、複数の遺伝子を候補として単離するに至った。現在はこれら遺伝子の機能を解析している段階である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)ClbRの相互作用因子の探索と機能解析
clbRを高発現した株では、糖質加水分解酵素遺伝子の発現量が (1) 増加 (2) 変わらない (3) 減少するものの、３パターンに分類された。MalE::ClbRおよびMalE::ClbR2リコンビナントタンパク質を用いて各遺伝子プロモーターへのそれぞれの蛋白質の結合特性をelectrophoresis mobility shift assay法により解析した結果、(1)増加する遺伝子プロモーターにはClbR単独で結合すること、(2)変動しなかった遺伝子プロモーターにはClbRとClbR2が協調的に結合すること、(3)減少した遺伝子プロモーターには、ClbR単独で結合しうることが in vitroの解析で示された。この結果は、これまでのin vivoにおける結果と一致する結果ではある。現在、His-tagged ClbRのAspergillus aculeatusにおける発現および検出条件を至適化している。
(2)新たなセルラーゼ遺伝子発現制御因子のスクリーニング・同定・機能解析
これまでに上述の転写因子ClbRだけでなく、二種の新たなタンパク質がセルラーゼ遺伝子発現を間接的、或いは直接的に制御していることを明らかにした。また、複数の制御因子候補株を取得しており、鋭意解析中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)ClbRの相互作用因子の探索と機能解析
ClbRのin vivoにおける翻訳後就職やDNA結合領域を限定することを目的として、His-tagged ClbR蛋白質の発現、抽出および検出条件を至適化している段階であり、今後翻訳後修飾を含め in vivo における機能解析を進める計画である。
(2)新たなセルラーゼ遺伝子発現制御因子のスクリーニング・同定・機能解析
新たに候補にあがった制御因子遺伝子の機能を解析するために、遺伝子破壊株およびその相補株を作出している。
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| Causes of Carryover |
キャンペーン期間にまとめ買いするなどの工夫により、消耗品費を節約したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当初の計画に比べ、数多くの新たな制御因子遺伝子の取得に成功しているため、次年度使用額を利用して新たな因子の機能を解析する。
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