2013 Fiscal Year Research-status Report
放線菌汎用宿主における有用物質生産を目指した高分子DNA導入法の開発
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25450112
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
小松 護 北里大学, その他の研究科, 講師 (40414057)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Streptomyces / conjugation / liner plasmid / secondary metabolism / synthetic biology |
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| Research Abstract |
我々は放線菌Streptomyces avermitilisの大規模欠失体 (SUKA) を宿主とした異種微生物由来の二次代謝産物生産について報告してきた。I型ポリケチド合成酵素や非リボソーム型ペプチド合成酵素によって生成する化合物の生合成遺伝子群は100 kbにもおよび、そのような化合物の異種生産を行うためには宿主に対する効率的な遺伝子導入方法が必須である。放線菌は一般的に大腸菌で調製したDNA(Dam Dcmによる修飾された)を制限するが、S. lividansは他の菌株と比べDam Dcmで修飾されたDNAの制限は低く、通常の大腸菌で調製した100 kb以上のBACクローンによって形質転換することができる。そこで、接合伝達性線状プラスミド(SAP1)を運び屋として、二次代謝産物生合成遺伝子群をS. avermitilis SUKA株に導入する方法を考案した。S. avermitilisならびにS. venezuelae由来の5種のアクチノファージ(φC31、R4、TG1、φK38-1、φBT1)のattBをタンデムに連結した人工DNAを合成し、それぞれSAP1上へ連結した。S. lividans内在性のattBを全て欠失した変異株に構築したSAP1ベクターを導入した。各ファージ由来の部位特異的組込み型プラスミドを導入した結果、SAP1上の各attBサイトにそれらプラスミドが部位特異的に組込まれた。また、I型ポリケチド合成酵素遺伝子を含む二次代謝産物生合成遺伝子群を保持する約100 kbのBACクローンにおいても、SAP1上のattBに部位特異的に導入することができた。得られたS. lividans形質転換体を供与菌として、S. avermitilis SUKA22株へ接合伝達した結果、接合体からBACクローンが導入されたSAP1が検出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
平成25年度において、当初の計画通り、予定した全ての実験行程ならびにその検証について順調に終えることができた。つまり、S. avermitilis内在性の線状プラスミドSAP1に対し、異なる5種のアクチノファージのアタッチメントサイト(attB)を導入したSAP1ベクターを構築した。さらに、S. lividansの染色体上より内在性のattBを全て除去することに成功し、S. avermitilisから接合伝達によりSAP1ベクターを当変異株に導入した。SAP1上に導入した全てのattBには、各ファージ由来の染色体組込型ベクターを全て部位特異的に導入できることを確認した。約100 kbのI型ポリケチド合成酵素遺伝子を含む二次代謝生合成遺伝子を保持するBACクローンを導入し、それがSAP1ベクター上に導入出来ることを確認した。また、S. lividansを供与菌としたS. avermitilis大規模欠失体との異種間接合伝達によって、上記の二次代謝生合成遺伝子を欠失等も無く、正確に伝達させることに成功した。当初の予定が順調且つ迅速に達成することができたため、既に次年度研究計画について前倒しして進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
我々は既に、DH10Bなどの通常の大腸菌株から調製した100 kb程度の二次代謝産物生合成遺伝子群を保持するBACクローンを形質転換法によりSAP1を保持するS. lividansに導入し、充分な効率でSAP1上に導入出来ることを確認した。しかしながら、100 kb程度のBACクローンを保持するSAP1では、S. lividansからS. avermitilis SUKA株への接合伝達効率が非常に低い。接合伝達は、両菌株から調製した胞子懸濁液を用いるが、これまでの解析から、使用する両菌株胞子懸濁液の混合比率が重要であることが判明している。スラント状に試験管内で作製した寒天培地上に両菌株胞子懸濁液を混合して塗布するのみで接合伝達が進行するが、培地組成の検討に加え、詳細な胞子懸濁液の混合比について検討する。
I型ポリケチド合成酵素遺伝子を含む二次代謝生合成遺伝子クラスターをはじめとする種々の巨大遺伝子断片を、当該法を用いてS. avermitilis SUKA株へ導入した後、培地検討などを含めた詳細な物質生産性の検討を行う。現在計画している二次代謝産物生合成遺伝子クラスターを次に記載する。asukamycin(約90 kb)、avermectin (約100 kb)、bafilomycin (100 kb)、diazepinomicin (70 kb)、Erythromycin (80 kb)、factumycin (100 kb)、geldanamycin (100 kb)、oligomycin (110 kb)、nemadectin (100 kb)
これらは、既に医薬品や家畜薬として使用されている物に加え、極めて特異な新規生合成反応機構を有しているものなど、産業的にも学術的にも非常に興味の持たれる物を選択した。
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[Journal Article] Engineered Streptomyces avermitilis host for heterologous expression of biosynthetic gene cluster for secondary metabolites.2013
Author(s)
Komatsu M, Komatsu K, Koiwai H, Yamada Y, Kozone I, Izumikawa M, Hashimoto J, Takagi M, Omura S, Shin-ya K, Cane DE, Ikeda H.
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Journal Title
ACS synthetic biology
Volume: 19
Pages: 384-396
DOI
Peer Reviewed
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