2015 Fiscal Year Annual Research Report
糸状菌の鉄ホメオスタシスに関わる転写制御因子HapXの機能解析
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25450116
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| Research Institution | Meijo University |
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Principal Investigator |
加藤 雅士 名城大学, 農学部, 教授 (70242849)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
志水 元亨 名城大学, 農学部, 助教 (20423535)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 鉄のホメオスタシス / 糸状菌 / 転写因子 / HapX / CCAAT / 転写抑制 / Hap複合体 / 鉄硫黄クラスター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1)HapB/C/EとHapXの相互作用の解析：蛍光プローブを使用した非アイソトープのゲルシフト解析法を確立し、HapB/C/EとHapXの相互作用を鋭敏に検出することに成功した。また、N末端に存在する菌類において配列が高度に保存されたドメインを欠くような部分欠失変異HapXをリコンビナントタンパク質して調製することに成功した。これらの変異HapXを用いて蛍光ゲルシフト解析を行なったところ、このN末ドメインを欠くとHapB/C/EとHapXの相互作用が見られなくなることから、同ドメインがHapXのHapB/C/Eとの相互作用に関与することが明らかとなった。また、これらの変異HapXを糸状菌において発現させin vivoでの解析を行なったところ、HapXの機能がほとんど見られなくなることから、同ドメインのin vivoでの重要性も確認された。
2)C末端のシステインリッチドメインに着目した解析：大腸菌を用い、同ドメインをmgオーダーで取得することに成功した。分光学的に解析を行なったところ、鉄硫黄クラスターに特有の吸収スペクトルが確認できた。システイン残基を改変した変異タンパク質をいくつか取得し、吸収スペクトルを測定したところ、吸収スペクトルの減少しているものが得られた。現在、詳細な解析を進めている。
3)HapXと相互作用するタンパク質の同定：HapXにTAPタグ（Tandem Affinity Purification Tag)を融合し、糸状菌内で発現させる系を確立した。温和な条件でHapXを精製したところ、HapXと相互作用しているタンパク質がいくつか検出された。これらのタンパク質をTOF-MASSにて解析したところ、興味深いタンパク質がいくつか同定された。現在、それら因子の欠失株の作製等、詳細な解析を進めている。
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