根粒菌外膜タンパク質TolCの生理的機能の解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25450117
• Research Institution: Ritsumeikan University
• Principal Investigator: 江田 志磨 立命館大学, 生命科学部, 助教 (50420005)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 根粒菌 / 外膜タンパク質 / TolC

Outline of Annual Research Achievements

グラム陰性細菌の外膜タンパク質 TolCは、抗生物質の排出や菌体外毒素の分泌に関わるチャネルタンパク質として長らく研究されてきた。ところが近年、これらの機能とは別の生理的機能を有する可能性が示された。マメ科植物のアルファルファと共生するアルファルファ根粒菌では、tolC 遺伝子が変異すると細胞膜の健全性が低下し共生不全になる。この原因を明らかにするため、当該年度は、前年度取得した複数の復帰変異株の解析を進めた。
アルファルファ根粒菌tolC変異株にトランスポゾンのランダム変異を導入することで得られた複数の復帰変異株について、トランスポゾンの挿入部位を調べたところ、ストレス応答に関わる遺伝子の近傍または機能未知遺伝子に挿入があることが分かった。今後、ストレス応答とTolCとの関係について、および機能未知遺伝子の働きについて解析を進めることでTolCの生理的機能が明らかにできると考えられる。
大腸菌ではtolC 変異により鉄キレート分子が分泌できずペリプラズムに蓄積し、それが細胞障害を引き起しているとの報告がある（Vega DE and Young KD, Mol. Microbiol. 2014. 91:508-521）。そこで、アルファルファ根粒菌tolC変異株においても鉄キレート分子の分泌異常が起きているか調べた。鉄の濃度を変えて野生株とtolC 変異株を培養し、菌体内外に存在する鉄キレート分子の量を比較したが、両株の間に大きな違いは認めらなかった。さらに、tolC 変異株を鉄過剰条件で培養しても細胞膜異常は回復しなかった。したがって、アルファルファ根粒菌では、大腸菌とは異なる機構で細胞障害が起きていることが明らかになった。
また、アルファルファ根粒菌と同属の根粒菌２種においてtolC 変異株を作製した。これにより近縁菌間でTolCの機能を比較することが可能になった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当該年度は、以下に述べる４項目の実施を計画していた。一部遅れている項目もあるが、全体としておおむね計画通りに進んだと判断した。
１）復帰変異株の遺伝学的な解析では、トランスポゾンによる遺伝子破壊で得られた２株の復帰変異株について変異部位が同定できた。変異部位が異なる遺伝子にあったので、これら復帰変異株の共通点と相違点からTolCの機能が浮かび上がると期待できる（順調に進んでいる）。変異誘発で得られた復帰変異株では、最終的な変異部位の同定には至っていないが、変異のある領域を絞り込むことができた（やや遅れている）。
２）tolC変異株の遺伝子発現の網羅的解析では、菌体外多糖の合成に関わる遺伝子群の解析を中心に進めた。tolC変異株では、共生に必須な菌体外多糖の分泌がみられないため、この多糖の合成や輸送に関わる遺伝子の発現が低下している可能性があった。定量的PCRによりこれらの遺伝子の発現量を調べたところ、tolC変異株の発現量は野生株と同レベルであった。TolCの菌体外多糖分泌への関与は、転写以降の過程で起きていることが明らかになった（順調に進んでいる）。
３）他の根粒菌および近縁菌のtolC 変異株の作製と解析では、アルファルファ根粒菌と同属の根粒菌２種においてtolC 変異株を作製することができた。次年度、近縁菌間でTolCの機能を比較することが可能になった（順調に進んでいる）。
４）大腸菌 tolC 変異株との比較では、鉄キレート分子の分泌に関して調べた。鉄の濃度を変えてアルファルファ根粒菌の野生株とtolC 変異株を培養し、菌体内外の鉄キレート分子の量を比較したが、両株の間に大きな違いは認められず、また鉄過剰条件においてtolC 変異株の細胞膜異常は回復しなかった。アルファルファ根粒菌では、大腸菌とは異なる機構で細胞障害が起きていることを明らかにすることができた（順調に進んでいる）。

Strategy for Future Research Activity

当該年度の研究により、２株の復帰変異株の変異部位を同定することができた。そこで、これらの変異株の解析を進める。両復帰変異株の遺伝子発現や膜タンパク質発現のプロファイルを詳しく調べ、共通点および相違点を明らかにすることでTolCの機能との関連を予測する。また、残る復帰変異株についても変異部位の同定し、より多くの復帰変異株を比較することで機能予測を進める。
近年の研究により、TolCを外膜チャネルとする輸送タンパク質複合体の輸送機能を阻害する分子が発見されてきている。そこで、これらの阻害剤を用いた解析を次年度の計画に追加する。輸送機能特異的な阻害剤を用いることで、tolC 変異により引き起される多数の表現型の変化のうち、どの変化が輸送機能と直接関係しているのかを調べることができる。
上記以外に計画の変更はなく、当初の計画の通り当該年度に引続き、１）復帰変異株の遺伝学的な解析、２）tolC変異株の遺伝子発現の網羅的解析、３）他の根粒菌および近縁菌のtolC 変異株の作製と解析、および４）大腸菌 tolC 変異株との比較を進める。

Causes of Carryover

変異誘発で得られた復帰変異株の変異部位を同定するため、当初の計画では、当該年度に数株（１または２株）の復帰変異株について次世代シークエンサーを用いた全ゲノム塩基配列解析を行う予定であった。しかし、期待していた以上の数の復帰変異株が得られた。研究目標を達成するためには、できるだけ多くの復帰変異株の変異部位を同定する方が望ましいと判断し、より時間を要するが、変異のある領域を絞り込んだ上でその領域のみの塩基配列を解析することにした。この計画変更のため、当該年度の次世代シークエンサー解析費用を、次年度の塩基配列解析費用（従来のシークエンサーを用いた塩基配列解析の費用）に当てることにした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

前項で述べた通り、多数得られた復帰変異株の変異部位を同定するための塩基配列解析に使用する。