Isolation of intracellular symbiotic bacteria of chemotroph.

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25450122
• Research Institution: Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology
• Principal Investigator: 能木 裕一 国立研究開発法人海洋研究開発機構, 海洋生命理工学研究開発センター, 技術副主幹 (70399559)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 共生菌 / ハオリムシ / 難培養微生物

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、今まで分離・培養できなかったハオリムシ（深海生物）の細胞内共生微生物を分離・培養する事である。また、その分離・培養手法を用いて難培養微生物を単離する事である。
本年度は共生菌を生きたまま純粋分離する方法を確立した。ハオリムシの共生菌を細胞内から単離するには生体を殻から出し、前処理として抗生物質と70％アルコールでハオリムシ生体表面に付着した菌を殺菌する事が重要であった。効率よく分離する事と前処理からのダメージを考え生体のルート部分の共生菌が最も多く存在する部位のみを使用した。生体から細胞を絞り出し、細胞破砕を行う際に乳鉢を使用し出来るだけ多くの細胞を潰すようにして細胞内容物をバッファーに懸濁した。懸濁液を培養に用いるよりも懸濁液から共生菌を分離するためには微弱電流パルスを用い電極に吸着させる方法が最も有効であった。それにより分離した菌から抽出したDNAの16S rRNA遺伝子解析は分離時に確認した共生菌の16S rRNA遺伝子と同一であることが確認できた。前処理の時間と抗生物質濃度がその後の菌の増殖に大きく影響し、分離時点では生存試験により生きていることが確認できた菌の多くの増殖能が低下する問題はやや改善していた。新鮮なハオリムシが入手困難なため、冷凍保存してあるサンプルを使用した。冷凍保存サンプルは採取直後新鮮な生育個体に比べ生存共生菌量が大幅に少なく、単離できる生きた共生菌の量は少なかった。
サガミハオリムシから純粋分離した細胞内共生菌を各種培地、培養条件にて至適培養条件の検討を行った。その結果、高濃度血清添加培地で炭酸ガス濃度、硫化水素濃度と添加方法、酸素濃度が培養条件に重要であることが分かった。また、前処理法を変えた為に細胞外の共生菌が幾つか分離できた。これらは分離した菌から抽出したDNAの16S rRNA解析により2新属新種、1新種と推定された。