2013 Fiscal Year Research-status Report

ハイスループットバイオフィルム薬剤感受性試験法の開発と抗バイオフィルム素材の探索

Research Project

Project/Area Number	25450123
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Research Institution	Fukuoka Industrial Technology Center
Principal Investigator	塚谷忠之福岡県工業技術センター, 生物食品研究所, 専門研究員 (50463500)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	バイオフィルム / 薬剤感受性試験 / 微生物検出 / 抗生物質 / 最小発育阻止濃度 / 最小殺菌濃度 / 最小撲滅濃度
Research Abstract	本年度は１．ペグ付きマイクロプレートフタへの最適なバイオフィルム形成法の確立、２．バイオフィルム評価用微生物検出法の最適化、３．バイオフィルム形成法及び微生物検出法を組み合わせたバイオフィルム薬剤感受性試験法の確立を実施した。バイオフィルム産生菌としてPseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus 、Candida albicansなど11種類の微生物を対象として、ペグ付きフタへのバイオフィルム形成法を確立することができた。形成条件としては、ペグ素材、前培養法、培地種類、形成時間、振とう有無、温度を検討し、各種微生物に最適な条件を確立した。次に、P. aeruginosa、S. aureus 、C. albicansの形成したバイオフィルム内の微生物を検出するために、電子メディエータ及び発色検出試薬水溶性テトラゾリウム塩WSTシリーズの中から最適な組み合わせを選抜した。微生物による代謝効率や培地成分による影響を考慮したところ、2-methyl-1,4-naphtoqiunoneとWST-8の組み合わせが最適であった。次に、バイオフィルム形成法及び微生物検出法を組み合わせることでバイオフィルム薬剤感受性試験法の確立を試みた。P. aeruginosa、S. aureus 、C. albicansが形成したバイオフィルムを対象として、バイオフィルム最小発育阻止濃度（Biofilm MIC）、最小殺菌濃度（Biofilm MBC）及び最小撲滅濃度（Biofilm MEC）の逐次的測定を行うことが可能になった。本法は、従来法（マイクロウェルプレートの底に形成する方法）と比較して、洗浄などの操作性において格段に簡便な手法であった。また、Biofilm MECの検出時間は2時間程度であり、従来法の24時間を大幅に短縮することができた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度は、１．ペグ付きマイクロプレートフタへの最適なバイオフィルム形成法の確立、２．バイオフィルム評価用微生物検出法の最適化、３．バイオフィルム形成法及び微生物検出法を組み合わせたバイオフィルム薬剤感受性試験法の確立を試みた。その結果、１．Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus 、Candida albicansなど11種類の微生物でペグへのバイオフィルム形成条件を確立することができた。２．バイオフィルム評価用の検出試薬（2-methyl-1,4-naphtoqiunoneとWST-8）を選抜することができた。2時間でバイオフィルム内の生菌を検出することができた。３．バイオフィルム形成法及び微生物検出法を組み合わせることで、バイオフィルム最小発育阻止濃度（Biofilm MIC）、最小殺菌濃度（Biofilm MBC）及び最小撲滅濃度（Biofilm MEC）の逐次的測定を行うことが可能になった。以上の理由から、当初の計画通り進展している。
Strategy for Future Research Activity	平成２６年度は、バイオフィルム産生菌及び複数の抗生物質の組み合わせを用いて本試験法による一斉評価を行う。まず、それぞれのバイオフィルム産生菌に対して個々の抗生物質のBiofilm MIC、Biofilm MBC及びBiofilm MECを求める。次に有望な抗生物質を中心に複数の組み合わせを評価する。これによりそれぞれのバイオフィルムに対して効果的な抗生物質の組み合わせに関する新たな知見を取得する。平成２７年度は、食材、食品副産物（未利用物）、木材等を中心に収集した試料を粉砕・乾燥し、水、熱水、エタノールの３手法で抽出したものを冷凍ストックした素材ライブライリーに対して、25～26年度に確立した本試験法を適用し、抗バイオフィルム活性のある素材をスクリーニングする。１次スクリーニングの指標としてはBiofilmMICあるいはBiofilmMECを用いる。次に、１次スクリーニングで抗バイオフィルム活性が認められた素材については、Biofilm MIC、Biofilm MBC及びBiofilm MECの逐次測定やドーズ・レスポンス曲線の取得など詳細な検討を行い、抗バイオフィルム素材としての有用性を検討する。さらに、ハイスループットなバイオフィルム薬剤感受性試験法の確立、抗バイオフィルム活性を有する抗生物質の組み合わせに関する知見、抗バイオフィルム素材に関する知見について得られた成果をとりまとめ、学会発表及び論文投稿を行う。