酸素耐性ヒドロゲナーゼの結晶構造に基づく変異導入実験に向けた最適発現系の構築

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25450125
• Research Institution: Ibaraki University
• Principal Investigator: 西原 宏史 茨城大学, 農学部, 教授 (10260465)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: ヒドロゲナーゼ / 水素酸化細菌 / 水素 / 燃料電池触媒 / 蛋白質発現

Outline of Annual Research Achievements

ヒドロゲナーゼは水素の分解と合成を行うことができる酵素であり、水素燃料電池用触媒や水素生産への利用が期待される。酸素が存在する環境で機能することができるHydrogenovibrio marinus由来の酸素耐性膜結合型ヒドロゲナーゼ（HmMBH）の結晶構造情報に基づく変異導入実験等を可能にするため、通性独立栄養性で遺伝子操作系の開発が進んでいるRalstonia eutrophaにおける発現を検討する。HmMBHをシトクロムとの複合体構造をもつ細胞膜局在酵素として発現することを試みるために、平成25年度はH. marinusより取得されている構造遺伝子と成熟化関連蛋白質遺伝子による発現ベクターの構築を進め、ヒドロゲナーゼ欠損変異株であるHF424株に導入したHF424MH31株を取得することができた。今年度は本形質転換株をR. eutropha由来のヒドロゲナーゼ・プロモーターが機能する条件で培養し、細胞分画を行って水素酸化活性を測定したところ、細胞膜画分にR. eutropha野生株の活性に対して約30%に相当する有意な活性が検出された。また、HmMBHの膜への局在化はTatシステム依存的であり、細胞膜に局在化される前に細胞質内で機能的な触媒単位（大小サブユニット二量体）が形成される。HF424MH31株によるHmMBHの機能的発現が確認されたことから、小サブユニットのシグナルペプチドを削除し、二量体ヒドロゲナーゼの細胞膜への局在化を妨げることで、可溶性酵素として発現させることを試みるためのベクター構築を進めた。当該領域を除くように遺伝子の一部をPCRで増幅し、配列を確認した後、下流部分を連結したプラスミドを作成した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

H. marinusで取得されているMBH成熟化関連蛋白質と構造遺伝子をヒドロゲナーゼ・プロモーター制御下に共発現させる方法によって、R. eutrophaの細胞膜画分に有意な水素酸化活性の発現を確認することができた。そこで、さらに発現酵素の精製が容易になることが期待されることから、MBHがTatシステムに依存する酵素であることを利用して、細胞膜への局在化を妨げて触媒単位（二量体）のみを可溶性酵素として発現させる試みへと実験を進めることができた。このことはおおむね計画通りであり、順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

HmMBH触媒部位の可溶性酵素としての発現について、平成26年度に構築した発現用ベクターのR. eutrophaヒドロゲナーゼ欠損変異株（HF424株）への導入を進め、形質転換株を選抜・取得する。その後、ヒドロゲナーゼ・プロモーターが機能する条件で培養した場合のHmMBHの発現、およびその局在性について調べる。その結果により、細胞膜に局在する状態での発現に成功しているHF424MH31株と共に、発現されたHmMBHの効率的な精製法の確立を目指す。

Causes of Carryover

当初予定より若干安価に済ませることができたため、千円単位の端数が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成27年度実施分の支払請求額とともに、当初計画通りに使用する。