2015 Fiscal Year Annual Research Report
酸素耐性ヒドロゲナーゼの結晶構造に基づく変異導入実験に向けた最適発現系の構築
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25450125
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| Research Institution | Ibaraki University |
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Principal Investigator |
西原 宏史 茨城大学, 農学部, 教授 (10260465)
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2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ヒドロゲナーゼ / 水素酸化細菌 / 水素 / 燃料電池触媒 / 蛋白質発現 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒドロゲナーゼは水素の分解と合成を行うことができる酵素であり、水素燃料電池用触媒や水素生産への利用が期待される。絶対独立栄養性水素酸化細菌Hydrogenovibrio marinus由来の酸素耐性膜結合型ヒドロゲナーゼ（HmMBH）の結晶構造情報に基づく変異導入実験等を可能にするため、通性独立栄養性水素酸化細菌Ralstonia eutrophaにおける発現を検討した。平成25～26年度はHmMBHをシトクロムとの複合体構造をもつ細胞膜局在酵素として発現することを試みるために、構造遺伝子と成熟化関連蛋白質遺伝子のR. eutrophaヒドロゲナーゼ欠損変異株への導入を進め、細胞膜画分にR. eutropha野生株の活性に対して約30%相当の有意な活性が発現された。また、MBHは細胞質内で機能的な大小サブユニット二量体が形成されることから、細胞膜の透過に必要なシグナルペプチドを削除して可溶性酵素としての発現を試みるためのベクター構築を進めた。平成27年度は形質転換株を取得し、可溶性画分において10 U/mlを超える強い活性を確認することができた。また、シグナルペプチドを削除してもなお、一部で膜への局在化が起こることが示唆された。反応最適温度は細胞膜画分で80℃、可溶性画分で60℃と好熱性であり、HmMBH遺伝子産物であることが確認されたが、野生型酵素と同等の耐熱構造を形成するには細胞膜への局在化が必須であることが示唆された。そこで、細胞膜局在酵素として発現させた組換えHmMBHの精製を試み、膜画分に対して精製倍率49.3倍の精製酵素を得ることができた。MBHの酸素耐性機能に関連する酸素還元活性について野生型精製酵素と比較し、同等であることが確認された。
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| Remarks |
https://info.ibaraki.ac.jp/Profiles/4/0000335/profile.html
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