Pichia酵母での蛋白質細胞表層発現：ハイスループット発現系構築法の開発と応用

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25450126
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 水谷 公彦 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (40314281)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: タンパク質工学 / Pichia pastoris / 発現系構築

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、細胞壁に局在するタンパク質Pir3pをアンカータンパク質として用いて、メタノール資化性酵母Pichia pastorisの細胞表層にタンパク質を発現させる。申請者が開発したP. pastoris細胞内でのDNA間の騒動組み換えを利用する方法で迅速（ハイスループット）に発現系の構築を行う。さらに、両端にタンパク質を融合できるPir3pの特徴を生かしN末端側に蛍光タンパク質GFPを融合することで迅速に発現量・位置の評価ができる方法を開発し、その応用を検討する。
平成26年度は、平成25年度に開発した新しい細胞表層発現用プラスミドpPrAS-ESPIR3FSを用いて、GFP-PIR3p-メダカαアミラーゼ融合体の発現系をP. pastoris GS115株で構築した。その結果、メタノールで誘導をかけつつ増殖させた場合に、GFP-PIR3p-メダカαアミラーゼ融合体の細胞表層への良好な発現が見られた。さらに、GFP-PIR3p-メダカαアミラーゼ融合体を発現した菌体がデンプンを分解することを確認した。（Pichia pastorisはデンプン分解酵素を持たないため、デンプンは発現したメダカαアミラーゼによって分解された。）

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

開発したプラスミドpPrAS-ESPIR3FSを用いて、平成26年度にGFP-Pir3p-トランスフェリン融合体の発現系を構築し、菌体による金属イオンの回収を検討する計画であったが行うことが出来ていない。これは、前述のGFP-Pir3p-メダカαアミラーゼ融合体のデンプン分解活性が比較的弱く酵素活性測定などに時間がかかったこと、研究代表者に対して学生の分属がなく研究代表者のみで全ての実験を行ったことが原因である。GFP-Pir3p-メダカαアミラーゼの酵素活性測定に成功したことから、大きな遅れはなく研究を続けることが出来ると考えている。

Strategy for Future Research Activity

平成27年度は以下のように研究を実施する計画である。
「トランスフェリンによる様々な金属の回収」
ニワトリトランスフェリン遺伝子を用い、1-2と同様に発現系の構築、発現誘導を行う。その菌体を、ガリウム、インジウム、またはビスマスを含む溶液に懸濁する。回収後の菌体に結合する金属の量をICP-AES法で定量する。トランスフェリンは二つの向かいあうリシン残基により酸性条件下で金属を放出するため、片方のリシンをグルタミンまたはグルタミン酸に変えた変異体も作成し、金属が溶けやすい酸性の溶液からの金属の回収も可能な方法を開発する。
「貝のセルラーゼ、ヘミセルラーゼによる水草・海藻からのバイオエタノールの生産」
アメフラシ、カワニナのセルラーゼ、ヘミセルラーゼ遺伝子を用い、1-2と同様に発現系の構築、発現誘導を行う。琵琶湖からオオカナダモ、海からホンダワラを採取し乾燥粉砕を行う。菌体を水草・海藻粉砕物2%懸濁液と混ぜ30℃、24時間反応を行い、溶液中のエタノール濃度を酵素法(ADH-NAD)で正確に定量する。

Causes of Carryover

やや実験に遅れが生じたためDNAプライマーなどの消耗品の購入額が少なくなった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

今年度行う予定であった実験も含めて、次年度に行う。