2016 Fiscal Year Annual Research Report
Cell surface expression of proteins using Pichia yeast: Development and application of high-throuput construction of expression system
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25450126
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
水谷 公彦 京都大学, 農学研究科, 助教 (40314281)
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2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | タンパク質工学 / Pichia pastoris / 発現系構築 / X線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者が開発したハイスループットで酵母Pichia pastorisの発現系を構築する方法を応用し、P.pastorisによるタンパク質の細胞表層発現、生産したタンパク質の結晶構造解析を行った。
細胞壁に局在するタンパク質Pir3pをアンカータンパク質として用いて、P. pastorisの細胞表層にタンパク質を発現させた。両端にタンパク質を融合できるPir3pの特徴を生かしてC末端側に目的タンパク質、N末端側に蛍光タンパク質GFPを融合することで迅速に発現量・位置の評価が出来る方法を開発した。研究代表者が開発したプラスミドp9PrASおよびpESPIR3FSから、新しい細胞表層発現用プラスミドpESPIR3FSを開発した。本プラスミドをP. pastoris KM71株、GS115株に導入してGFP-Pir3p融合体の発現量、位置の確認を行った結果、GS115株を用いた場合にGFP-Pir3p融合体の細胞表層への良好な発現が見られた。さらに、GFP-Pir3p-メダカαアミラーゼ融合体の発現系を構築しGS115株で発現誘導を行ったところ、同様に細胞表層への良好な発現が見られ、菌体がデンプン分解活性を持つことを確認した。
二枚貝シジミおよび巻貝Ampullaria crosseanのGH45ファミリーセルラーゼ（エンドグルカナーゼ）の発現系構築、生産を行った。コドンを最適化した人工遺伝子DNAを購入し、ハイスループット法で発現系を構築し、どちらのセルラーゼもカルボキシメチルセルロース分解活性を持つことを確認した。両セルラーゼについて大量生産、結晶化を試み、巻貝のセルラーゼについて結晶構造を決定した。さらに変異体を発現生産し、その活性および結晶構造から触媒メカニズムの解析を行った。また、オボトランスフェリンN半分子について新しい良好な結晶化条件を発見し構造解析を行った。
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