2015 Fiscal Year Research-status Report
植物におけるcGMP/NOシグナリングの標的転写因子の同定と転写調節機構の解明
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25450127
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
山形 裕士 神戸大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (00159203)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 一酸化窒素 / 遺伝子発現調節 / ニコチアナミン合成酵素 / プロモーター / 転写因子 / GT-1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シロイヌナズナのT87細胞を用いる一過的遺伝子発現系により、一酸化窒素 (NO) によって発現が強く誘導されるニコチアナミン合成酵素遺伝子1（AtNAS1）のプロモーター解析を行い、AtNAS1の翻訳開始コドンの上流-94~-82塩基の配列（GCGAGGGTTAAAG）をNO応答に必要かつ十分な配列（NO-responsive element, NORE）として同定した。大腸菌で発現・精製した転写因子AtGT-1がこのNOREに強く結合すること、その結合にはGGTTAA配列が重要であることを明らかにした。一方、NO処理した組換えAtGT-1のNOREへの結合能が低下したことから、GT-1のS-ニトロシル化による調節機構の存在が示唆された。その際、AtGT-1はAtNAS1遺伝子のNO応答においてネガティブに作用する因子と予想されたので、プロトプラストを用いる一過的遺伝子共発現系でAtGT-1がポジティブな因子かネガティブな因子かを調べたが、再現性が得られず確証を得るには至らなかった。一方、シクロヘキシミドで前処理後にNO処理したT87細胞ではAtNAS1の発現誘導がまったく認められなかった。また、AtGT-1の発現量はシクロヘキシミドやNO処理により変化せず一定量が常時発現していた。これらの結果を総合して、NOによるAtNAS1の発現誘導には、AtGT-1の遺伝子発現抑制能の解除と、AtGT-1以外のポジティブに作用するタンパク質のde novo合成を必要とすることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
シロイヌナズナのNO応答性遺伝子発現調節の解明を目的として、NAS1遺伝子のプロモータ中にNO応答シスエレメント（NORE）を同定し、転写因子GT-1が結合することを示した。また、GT-1との結合に必要なNORE中の配列を1塩基レベルで同定出来た。また、GT-1のS-ニトロシル化によるDNA結合能の変化を明らかにした。さらに、NOによるNAS1遺伝子の発現誘導にはGT-1以外の新たなタンパク質合成が必要であることを明らかにした。GT-1以外の因子の関与を明らかにできたことは計画以上の進展であった。一方、cGMPにより多くの遺伝子が発現誘導または抑制されたが、cAMPにより発現が調節される遺伝子は極めて少なく、また発現の変動幅も小さいことを明らかにし、cGMPの特異性を示すことができたことは計画以上の成果であったが、cGMPによる遺伝子発現調節に関与する転写因子の同定には至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
NOによるAtNAS1遺伝子の発現誘導にはGT-1とともに、NOにより新たに合成される未知タンパク質を必要とすることが示唆されたので、この未知のタンパク質の同定を目指す。まず、NOにより発現が誘導される遺伝子を網羅的に解析し、その中からAtNAS1遺伝子のNOによる発現誘導に関与する因子を検索する予定である。
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| Causes of Carryover |
植物におけるcGMP/NOシグナル伝達の研究において重要な転写因子を複数見出した。それらの因子の細胞内での機能について詳細に解析した。これまでcGMPによる遺伝子発現調節については成果をまとめることができた。一方、NOによるNAS1遺伝子の発現調節については、当初予想した転写因子GT-1以外に、NOにより新たに合成されるタンパク質を必要とすることが示唆され、より詳細な解析が必要となったことから、次年度に一部研究を継続して研究成果を取り纏めることとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
すべて消耗品に使用予定である。具体的には、試薬類20万円、プラスチック器具類20万円、学会発表5万円、論文投稿費5万円の合計50万円を2016年度に使用する計画である。
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