2014 Fiscal Year Research-status Report
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25450132
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
秋田 充 愛媛大学, 農学部, 准教授 (50335890)
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2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 生化学 / 蛋白質輸送 / 葉緑体 / 分子間相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、独自の蛋白質輸送システムを有する葉緑体の蛋白質輸送時における同定済蛋白質輸送装置構成因子の連携と未同定蛋白質輸送装置構成因子の同定を目的としている。この目的の達成には、輸送基質である前駆体蛋白質に、蛋白質輸送チャンネルを塞ぐのに十分な大きさの立体障害を導入することで、前駆体蛋白質が輸送装置内で滞留した膜透過中間体の獲得が有効であると考えている。
立体障害をフォールドした蛋白質を連結することで形成させるためには、従来のように大腸菌で封入体として獲得した前駆体蛋白質を尿素で可溶化した後、蛋白質輸送実験に用いることに疑念を抱いた。そこで平成26年度は、前駆体蛋白質に異種蛋白質を連結し、大腸菌で発現した際に、その異種蛋白質がフォールディングした状態、すなわち可溶性の状態で獲得することを試みた。可溶性促進タグとTEVプロテアーゼ認識配列を前駆体蛋白質の葉緑体移行シグナルであるトランジット配列のアミノ末端に、可溶性蛋白質をカルボキシ末端部に連結した。トランジット配列カルボキシ末端と可溶性蛋白質との間は、ランダムコイル構造をとる、4個のグリシン残基と1個のセリン残基からなる繰り返し配列で連結した。蛍光蛋白質を可溶性蛋白質として用いることで、蛍光蛋白質が大腸菌内で発する蛍光を指標に、組換え蛋白質が可溶性状態で回収できることを確認した。さらに、大腸菌の抽出液をTEVプロテアーゼ処理することで、可溶性前駆体蛋白質を獲得することができた。
また、平成25年度に作製した大腸菌でin vivoでビオチン化するビオチンアクセプターペプチド(BAP)タグを連結した前駆体蛋白質に一価性ストレプトアビジン4量体を結合する条件検討した。その結果、ストレプトアビジンを前駆体蛋白質のカルボキシ末端部に付加することに成功した。今後はこれらの前駆体蛋白質の葉緑体への輸送がブロックされるかどうかを確認する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究実績の概要でも記したが、本研究は、蛋白質輸送チャンネルをふさぐ前駆体蛋白質の作製の成否が目的達成の大きなカギとなる。研究計画で提案した一部の課題については、すでに、確立している実験系であり、また、予備的な実験を実施済みであったりするために、平成26年度も前年度と同様に、前駆体蛋白質の改変を優先的に進めた。その過程で、分子量が大きくなるにもかかわらずゲル電気泳動での移動度が大きなどの予測しない実験結果が得られたりして、そのような問題を一つ一つ解決するために多くの時間を費やすこととなったため、進行がやや遅れているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度の研究実績により、膜透過中間体の形成に必要な材料が整いつつあるので、当初の研究計画に記した課題に取り組む。それらを具体的に記述する。
１．ストレプトアビジン付加前駆体蛋白質や可溶性前駆体蛋白質を用いた葉緑体蛋白質輸送実験：一価性ストレプトアビジンをビオチン化したBAPタグをカルボキシ末端に連結した前駆体蛋白質を獲得することが可能になったので、ストレプトアビジン付加前駆体蛋白質を用いた葉緑体蛋白質輸送実験を行う。また、異種蛋白質を連結した人工前駆体蛋白質を可溶性状態で獲得することができたので、精製した上で、人工前駆体蛋白質を用いた葉緑体蛋白質輸送実験を行う。蛋白質輸送条件下で輸送阻害が観察された場合、以下の２．に取り組む。；２．膜透過中間体を形成させた葉緑体からの中間体の可溶化と精製：回収した膜透過中間体を形成させた葉緑体懸濁液に界面活性剤を添加することで、包膜蛋白質を可溶化する。前駆体蛋白質には、Hisタグやビオチン化タグを挿入しているので、これらのタグを利用することで膜透過中間体を精製する。エネルギー制限条件下で形成される初期膜透過中間体に対しても同様の操作を行う。；３．膜透過中間体の解析：精製した膜透過中間体の構成因子をSDS-PAGEで分離し、解析する。推定分子量から未知因子の存在が推測される場合には、未知因子の同定するための作業に取りかかる。
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