2013 Fiscal Year Research-status Report
マイクロチューブを成す塩基性分岐多糖の構造決定と形態形成機作の解明
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25450148
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Yokohama National University |
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Principal Investigator |
武田 穣 横浜国立大学, 工学研究院, 准教授 (40247507)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | Thiothrix fructosivorans / 鞘 / 構造決定 / 希少糖 / ペロサミン / グルコサミノグルカン |
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| Research Abstract |
今年度の目標は、Thiothrix fructosivoransが形成するマイクロチューブ（鞘）の調製法を確立し、主に溶液NMR測定によって鞘をもたらす多糖（鞘形成多糖）の化学構造を決定することである。まず、溶菌酵素と弱いアルカリ処理で細胞を除去して鞘を得た。得られた鞘を固体NMR分析するとアセチル基の存在を示すシグナルが観測された。鞘に対して強いアルカリ処理すとこのシグナルは消失し、脱アセチル化されたことが分かった。鞘を部分加水分解すると塩基性多糖が遊離し、NMR測定でグルコサミノグルカン（D-グルコサミン・D-グルコース交互共重合体）と同定された。部分加水分解ではオリゴ糖も生じ、NMR解析によってフコースと希少糖であるペロサミン（4-アミノラムノース）とからなる2糖（Rha4NAc-Fuc）と判明した。フコースの絶対配置は(-)-2-ブチル配糖体への変換を経たGC分析でL体であることを確認した。2糖を加水分解することでペロサミンを遊離させ、N-アセチル化を施した後に比旋光度を測定した。比旋光度に基づいてペロサミンをD-体と同定した。鞘を脱アセチル化するとギ酸酸性下で易溶で詳細な溶液NMR分析が可能だった。観測されたシグナルから、グルコサミノグルカン中のグルコース残基の3位にD-Rha4NAc-L-Fucが結合していることが判明した。すなわち、T. fructosivoransの鞘形成多糖はグルコサミノグルカンを主鎖とし、D-Rha4NAc-L-Fucの側鎖を有する分岐型塩基性多糖であることが明らかとなった。さらに、グルコサミン残基およびペロサミン残基中のアミノ基は少なくとも部分的にN-アセチル化されていると予想された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の目標は、Thiothrix fructosivoransが形成するマイクロチューブ（鞘）の調製法を確立し、主に溶液NMR測定によって鞘をもたらす多糖（鞘形成多糖）の化学構造を決定することであった。鞘の部分分解物の分析と鞘の誘導化（脱アセチル化による可溶化）物の分析によって、鞘形成多糖の基本的化学構造を決定することができた。また、少なくとも部分的にN-アセチル化されていることも示した。鞘形成多糖の主鎖を成すグルコサミノグルカンは近縁種であるThiothrix niveaの鞘にしか見出されていかなった希少な多糖であり、Thiothrix属の鞘に共通する化学的特徴を明らかにすることができた。さらに、側鎖を成す2糖に含まれるペロサミンは、これまで大腸菌O-157や病原性ビブリオなどの細胞壁成分（リポポリサッカライド）の構成糖としてしか存在が認められていなかった希少糖であり、菌体外高分子における存在の確認は今回が初めてである。希少糖の機能を探る上で重要な発見であり、論文での公表に至ったことからも評価に値すると思われる。しかしながら、本来の目的である鞘形成多糖の化学構造を決定という点においては、N-アセチル化の度合いとその部位の特定には至っておらず、厳密には構造を完全に決定できたわけではない。したがって、今年度の達成度はおおむね順調と捉えるのが適当と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度の研究は順調に進展したので、今年度は当初の計画に従ってThiothrix niveaの鞘形成多糖の構造決定を主たる達成目標とする。Thiothrix niveaの鞘形成多糖については、主鎖であるグルコサミノグルカンに未同定のデオキシ糖の修飾が施されている可能性が高い。鞘を可溶化する方法を確立し、溶液NMR測定を行うことによってデオキシ糖の同定と主鎖との結合様式の解明を行う予定である。さらに、アセチル化の状態についてはThiothrix fructosivoransの鞘形成多糖も含めて検討するつもりである。その方策としては当初、荷電状態から推算することを計画していたが、特にThiothrix fructosivoransの場合アミノ基はグルコサミンだけでなくペロサミンにも存在することから、単にアセチル化度を明らかにするだけでは不十分である。そこで、アセチル基を温存した状態での鞘の可溶化ないし部分分解手順を確立することによるアセチル化の度合いと部位の特定に挑む。
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