2013 Fiscal Year Research-status Report
放線菌二次代謝制御因子の解析および多面発現制御による生合成プラットフォームの構築
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25450155
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
荒川 賢治 広島大学, 先端物質科学研究科, 准教授 (80346527)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 放線菌 / 抗生物質 / オートレギュレーター / 制御遺伝子 / ゲノムマイニング |
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| Research Abstract |
本年度は以下の２項目の解析を進めた。
（１）二次代謝制御シグナルカスケードの網羅的解析
申請者らはS. rochei抗生物質制御カスケードについて、srrX(SRB合成酵素遺伝子)-srrA(SRBリセプター遺伝子)-srrY(SARP遺伝子)[-LC生産]-srrZ(SARP遺伝子)-LM生産、という主要経路を明らかにしている。また、２つめのリセプターSrrBは抗生物質生合成のアクティベーターsrrYプロモーター上流に結合したため、SRBとリセプターホモログの親和性の違いや時期特異的発現による巧妙な転写活性化調節機構の存在が示唆された。
本年度は、1)各制御遺伝子破壊株におけるsrrA,srrB,srrYの転写・抗生物質生産の経時変化解析、2)SrrA,SrrBとSRB間の結合アフィニティー解析、を行った。まず1)であるが、培養中期にsrrY,srrBの発現が開始され、後期にsrrYの転写抑制が生じることが分かった。これにより、２つのリセプターSrrA,SrrBによる巧妙な抗生物質の一過的生産が見いだせた。また、2)であるが、SrrB大量発現ベクターを構築し、良好なタンパク発現を確認した。現在SrrA-srrY,SrrB-srrY複合体へのSRB結合活性を調べている。
（２）染色体アーム領域塩基配列のアセンブルおよびORF解析
S. rochei染色体の塩基配列解析に関してContig配列およびコスミドライブラリー、PCR反応を組み合わせてアセンブル作業を進めたところ、100 kb以上のcontigが30本（最長Contig長; 392kb）得られ、他のcontigとあわせたカバー長は8.18Mbであった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）に関しては２つのリセプターによる抗生物質の巧妙な一過性生産を遺伝子発現レベルでも見いだすことが出来た。
（２）の染色体塩基配列解析であるが、contig数を２桁にまで絞り込むことが出来た。6コピーあるリボソームＲＮＡおよび多数のトランスポゾン領域のcontig連結には困難が考えられる。また制御遺伝子の多重変異株において、複数の二次代謝遺伝子の覚醒にも成功し、さらに本菌における線状プラスミドが線状染色体の線状構造を維持するのに必要不可欠であることを見いだすことが出来た。これらの発見は本菌の全ゲノム解析を行う上で強力なモチベーションとなっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）に関しては、次年度以降にフットプリントによる結合領域の特定やシグナル分子SRBの結合アフィニティーの解析を進める予定である。
（２）に関しては、重複塩基配列のcontig連結に対して次々世代シークエンサーの利用などを行う予定である。
また、平成２６年度には（３）ゲノムマイニングで発見したポリエンマクロライド抗生物質ペンタマイシンの生合成解析、（４）PQQモチーフを有する遺伝子の網羅的探索、を計画している。いずれも（２）の全塩基配列解析が密接に絡んだ研究課題であるので、有機的に組み合わせながら研究を遂行する所存である。
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