2014 Fiscal Year Research-status Report
カバノアナタケ菌に感染したシラカンバ幼植物体に生成する特異的タンパク質の画像解析
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25450204
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| Research Institution | Utsunomiya University |
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Principal Investigator |
横田 信三 宇都宮大学, 農学部, 教授 (60210613)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上高原 浩 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (10293911)
吉永 新 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (60273489)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | シラカンバ / カバノアナタケ / ペルオキシダーゼ / MALDI/TOF/MSイメージング / 樹病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度の研究では、昨年度に引き続き、癌腫病菌カバノアナタケIO-U1株に感染した、3ヶ月生及び6ヶ月生シラカンバ幼植物体No.8に発現する、菌感染特異的ペルオキシダーゼの組織内分布を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析法 (MALDI/TOF/MS)イメージング解析法を用いて検討した。3ヶ月生及び6ヶ月生のシラカンバ幼植物体を調製し、主茎に傷を付け、そこにカバノアナタケIO-U1株の菌糸体を接種した植物体 (T) を用意した。また、対照として、それぞれ無傷・無菌 (C1) 及び有傷 (C2) の植物体も用意した。各処理後、植物体を更に2、10、30日間培養した。各期間培養した植物体を収集し、処理部を採取した。採取試料を液体窒素で急速凍結し、横断面切片を作成した。得られた切片を用いて、昨年度、菌感染特異的ペルオキシダーゼのMALDI/TOF/MSにより得られたマススペクトルピークを基に、MALDI/TOF/MSイメージング解析を行った。昨年度と同様に、菌感染特異的ペルオキシダーゼに由来すると思われるシグナルは、3ヶ月生及び6ヶ月生両方において、木部全体に見られた。しかしながら、組織化学的染色によって観察された、菌感染特異的ペルオキシダーゼの局在は認められなかった。
本年度の研究においては、菌感染特異的に生成するフェノール性化合物のMALDI/TOF/MSイメージング解析も試みた。フェノール性化合物として、縮合型タンニンを候補化合物として推定しているが、切片の菌接種部位付近において、縮合型タンニン特有のMALDI/TOF/MSスペクトルを得ることが出来た。また、本年度では、細胞骨格タンパク質の一つである、アクチン繊維の蛍光試薬染色による顕微鏡観察を行った。その結果、T植物体から作成した横断面及び縦断面切片の両方において、菌接種部付近に、アクチン繊維の局在が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
菌感染特異的ペルオキシダーゼのMALDI/TOF/MSイメージング解析がうまく進展していない。得られるスペクトルシグナルにノイズが多く、明瞭なスペクトルピークがきちんと得られていない。また、微小管構成タンパク質の抽出も、前年度と同様に、きちんと進展していない。
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| Strategy for Future Research Activity |
菌感染特異的ペルオキシダーゼのMALDI/TOF/MSイメージング解析については、高分子量域のマススペクトルピークが検出し易いと考えられる、別のタイプのマトリックスを使用して実験を行う予定である。微小管構成タンパク質については、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いた観察も試みる。また、アクチン繊維の蛍光顕微鏡観察では、期待通りの結果が得られたので、アクチン繊維についてMALDI/TOF/MSイメージング解析を試みる予定である。更に、菌感染特異的フェノール性化合物として、縮合型タンニンと予想される化合物のMALDI/TOF/MSスペクトルが得られているので、縮合型タンニンを対象としたMALDI/TOF/MSイメージング解析を試みるつもりである。
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| Causes of Carryover |
本年度の研究において、菌感染特異的ペルオキシダーゼのMALDI/TOF/MSイメージング解析が、なかなかうまく進展しなかった。そのため、このMALDI/TOF/MSイメージング解析に要する器具や試薬等を計画通り購入出来ず、次年度使用額が生じてしまった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の研究においては、MALDI/TOF/MSイメージング用に、タンパク質の高分子量域のマスピークがより感度良く検出できると期待される、別のタイプのマトリックスを使用する計画である。このマトリックスを含め、菌感染特異的ペルオキシダーゼのMALDI/TOF/MSイメージング解析に必要となる、器具や試薬等を、次年度使用額と併せて計画的に使用する予定である。
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