2013 Fiscal Year Research-status Report
木材分解に関与する新規糖タンパク質の大量発現系の確立とバイオマスの効率的分解
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25450247
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kinki University |
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Principal Investigator |
田中 裕美 近畿大学, 農学部, 教授 (30140338)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 木材分解 / 水酸化ラジカル / 糖タンパク質 / タンパク質発現 |
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| Research Abstract |
白色腐朽菌のCeriporiopsis subverispora、褐色腐朽菌のFomitopsis palustrisおよびPostia placentaを木粉添加Kirk寒天培地で培養し、菌体外分泌物質を回収した。凍結乾燥によって濃縮後、Sephadex G-50によるゲルろ過クロマトグラフィー、DEAE Sepharose CL-6Bによるイオン交換クロマトグラフィーによって水酸化ラジカル生成物質を部分精製した。そのサンプルをTricine-SDS-PAGEによって分離後、PVDF膜にブロッティングし、バンドを検出後切り出しプロテインシークエンサーによってN末端アミノ酸配列の解析を行った。その結果、白色腐朽菌C. subvermisporaを用いて部分精製した水酸化ラジカル生成物質からは電気泳動後いくつかのバンドが検出され、そられのN末端アミノ酸配列を解析することができた。
また、次年度計画の予備実験として、すでに水酸化ラジカル生成物質のタンパク質部分の遺伝子が解析されている白色腐朽菌Phane-rochaete chrysosporiumにおいて、大腸菌によるタンパク質発現系を検討した。発現システムとしてpET Systemを用い、ベクターにpET32 Xa/LIC Vector、クローニング用宿主に大腸菌NovaBlue、発現用宿主に大腸菌BL21(DE3)を用いた系と、Profinity eXact Protein Purification Systemを用い、ベクターとしてRIC-Ready pPAL7 Vector、宿主として大腸菌C-Max 5αを用いた系を検討した。いずれの系もタンパク質を発現させることに成功したが、精製過程に問題があり、タンパク質を微量にしか得られなかった。今後は同じ真核生物である酵母を用いた発現系を検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
褐色腐朽菌のF. palustrisおよびP. placentaからは菌体外に存在する多糖類のためか、菌体外分泌物の回収量が白色腐朽菌に比べ少なかった。そのため、水酸化ラジカル生成物質をゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーと精製していく段階でさらにサンプルが減少してしまった。その結果、Tricine-SDS-PAGE後、ブロッテイングを行い、検出したバンドを切り出し、プロテインシークエンサーによってN末端アミノ酸配列解析まで至らなかった。
また大腸菌を用いた白色腐朽菌P. chrysosporiumの水酸化ラジカル生成物質のタンパク質の発現においては、精製過程に長時間を要し、その間にタンパク質にロスがでてしまった。
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| Strategy for Future Research Activity |
数種の白色腐朽菌および褐色腐朽菌を用いて、水酸化ラジカル生成物質のN末端アミノ酸配列や内部アミノ酸配列を解析する。この結果をもとにプライマーを作成し、RT-PCR法によって、ゲノムの塩基配列が解析されている木材腐朽菌の水酸化ラジカル生成物質遺伝子をクローニングする。遺伝子がすでに解析されているP. chrysosporiumにおいては、酵母を用いたタンパク質発現系を構築する。
また水酸化ラジカルが、この糖タンパク質によって連続的に生成されるためには電子供与体が必要である。白色腐朽菌P. chrysos- poriumは菌体外にNADHを分泌することが報告されている。そこで数種の木材腐朽菌を用いて、菌体外に分泌されるNADHおよびNAD+をMTT法を用いて分光光度計により測定する。分泌量の高かった腐朽菌については、HPLCによりNADHの定性・定量を行う。
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