2015 Fiscal Year Research-status Report
木材分解に関与する新規糖タンパク質の大量発現系の確立とバイオマスの効率的分解
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25450247
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| Research Institution | Kinki University |
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Principal Investigator |
田中 裕美 近畿大学, 農学部, 教授 (30140338)
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2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 木材分解 / 水酸化ラジカル / 糖タンパク質 / ピリジン補酵素 / 一電子酸化活性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
25、26年度の結果から、白色腐朽菌Ceriporiopsis subvermispora、褐色腐朽菌Fomitopsis palustrisおよびPostia placentaを木粉添加Kirk寒天培地で培養し、所定期間培養後酢酸緩衝液を用いて菌体外分泌物を回収した。凍結乾燥によって濃縮後、硫安沈殿、
Sephadex G-50ゲルろ過クロマトグラフィーにより水酸化ラジカル生成物質の部分精製を行った。これらの物質は２価の鉄、糖、タンパク質を含んでいた。その後SDS-PAGE後PVDF膜に転写、N末端アミノ酸配列を解析した。褐色腐朽菌に関しては、平行して水酸化ラジカル生成物質の回収量を増加させるため、エチレン発生量による一電子酸化活性の測定により培養条件の検討を行った。
この物質によって水酸化ラジカルが連続的に生成されるためには電子供与体の存在が必要であるが、電子供与体の候補としてNADHを想定し、ピリジン補酵素の定量を酵素サイクル法であるMTT法を用いて測定した。26年度に引き続き数種の白色腐朽菌、褐色腐朽菌、軟腐朽菌を用いて測定したが、今回はピリジン補酵素抽出の際にエタノールを添加する方法を検討した。その結果、いずれの菌でもエタノールを添加したほうがピリジン補酵素の存在量が多かった。木材を分解できる菌は連続的に水酸化ラジカルをを生産するために、菌体外に存在するピリジン補酵素を電子供与体としていることを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
全ゲノムの塩基配列が解析されている褐色腐朽菌Postia placentaやGloeophyllum trabeumは生育があまりよくなく、水酸化ラジカル生成物質を大量に得ることが困難であった。そこで、木粉の樹種やグルコース濃度を検討するなど培養条件の検討を行った。そのため、菌体外分泌物から水酸化ラジカル生成物質を分離・精製してN末端アミノ酸配列解析は行ったが、詳細な分析や遺伝子のクローニングまで至らなかった。
木材を分解できる白色、褐色、軟腐朽菌ではピリジン補酵素が菌体外に存在することを示したが、27年度はピリジン補酵素抽出の際にエタノールを添加することにより、より確実に測定できることを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporiumの水酸化ラジカル生成物質の遺伝子を既に解析しているが、全ゲノムの塩基配列が解析されている褐色腐朽菌Postia placentaやGloeophyllum trabeumからも遺伝子をクローニングする。その中から大量発現に最適な遺伝子を検討し、発現系を構築することによって詳細な水酸化ラジカル生成機構を解明する。
木材を分解できる白色、褐色、軟腐朽菌ではピリジン補酵素が菌体外に存在することをすでに示したが、28年度は27年度に検討したピリジン補酵素抽出の際にエタノールを添加する方法を用いて、さらに複数の菌類を用いて測定する。さらに菌体内のピリジン補酵素を測定し、菌体外・内の関連を検討する。
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Research Products
(2 results)
