2013 Fiscal Year Research-status Report
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25450308
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
篠村 知子 帝京大学, 理工学部, 教授 (80579235)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | バイオエネルギー / 強光 / 低温 / カロテノイド / ユーグレナ |
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| Research Abstract |
平成２５年度には、ほぼ申請時の計画に沿って研究を実施した。以下に主要な結果を記述する。
「強光照射時の細胞応答の解析」について、ユーグレナ細胞を本研究室の「標準的な培養条件」（50μmolm-2s-1、水温25℃）及び細胞増殖が著しく阻害されかつ細胞内に赤褐色の色素を蓄積する「強光・低温条件」（250μmolm-2s-1、水温20℃）にて培養し、それらの細胞に蓄積する色素がカロテノイドであることを確認し、その分子種の組成比について、薄層クロマトグラフィーやHPLCを用いて測定した。その結果、これらの細胞におけるカロテノイド類ではdiadinoxanthinが約75~80％を占める主要な分子種であること、標準的な培養条件から強光・低温条件に移して3日間を経過した細胞では、クロロフィル量に対する全カロテノイド量の比率が増加する傾向にあり、いくつかの分子種では含有量の増加や減少が観察された。これにより、ユーグレナ細胞が強光・低温の刺激を受けて増殖阻害を受けると同時にカロテノイド合成が促進されることは明確になった。
「強光応答に関わる遺伝子の探索」については、カロテノイド合成系の最も上流に位置するフィトエン合成酵素（PSY)について、既知のゲノムデータベースにおいてPSYとしてアノテーションされている遺伝子配列を選び、そのアミノ酸配列をもとに、石川教授（島根大）の協力を得てユーグレナESTデータベースと照合するBLAST検索を行い、シロイヌナズナのPSYとのアミノ酸配列が約50％の相同性を示すEST配列を見出した。この配列を含むmRNAがユーグレナ細胞において実際に発現していることをPCR法により確認した。これらの結果から、当該EST配列はユーグレナにおけるPSYのオーソログであることが強く示唆されたので、今後、その遺伝子のより詳細な解析を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２５年度には、ほぼ申請時の計画に沿った実験に一通り着手して前記の成果を得たので、次年度以降の推進方針を明確にすることができた。
特に「強光照射時の細胞応答の解析」においては、強光・低温条件で細胞増殖が著しく阻害されながらも増殖して実験に必要な材料を確保できるような実験条件を確立し、必要十分量の材料を培養し、高市准教授（日本医大）の協力を得て薄層クロマトグラフィーやHPLC分析によりカロテノイドの分子種を特定して定量する実験系をほぼ確立することができた。これにより、ユーグレナ細胞が強光・低温の刺激を受けて増殖阻害を受けると同時にカロテノイド合成が促進されることが明らかになったので、関連遺伝子の探索へと研究を前進させるための指針を明確にすることができた。
「強光応答に関わる遺伝子の探索」では、ゲノム情報が未公開のユーグレナを材料に効率よく遺伝子探索へとアプローチするための手順を確立する必要があった。そこで、フィトエン合成酵素に着目して手順の確立を目指した。その結果、 (1) カロテノイド合成系に関してはモデル生物の当該遺伝子情報がある程度蓄積しているので、これもとにユーグレナESTデータベースと照合するBLAST検索により相同性を示すEST配列を見出し、(2)そのEST配列を基にRT-PCRにより遺伝子の実在を確認し、(3)遺伝子クローニングや発現量解析を行うというアプローチを適用することで、効率よくユーグレナにおけるカロテノイド合成系酵素遺伝子群の研究を推進できる見通しを得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度以降は、「強光照射時の細胞応答の解析」および「強光応答に関わる遺伝子の探索」については、ほぼ、当初の計画通り研究を推進する。「強光照射時の細胞応答の解析」については、平成25年度に確立した実験系を用い、強光・低温の刺激を受けて増減するカロテノイド分子種について、その増減量の経時変化をより詳細に解析し、強光応答としてのユーグレナ増殖に及ぼすカロテノイド機能の解析を進める。「強光応答に関わる遺伝子の探索」についても、平成25年度に確立したアプローチにより、ユーグレナにおけるカロテノイド合成系酵素遺伝子群の発現解析や全長クローニングおよび機能確認を行い、強光応答との関連を調べる。
一方、提案時に設定した「UV 光の及ぼす細胞への影響の解析」については、実際に屋外の太陽光に含まれるUV光のユーグレナ細胞増殖への影響を確認するため、屋外での培養実験を行い、太陽光に含まれるUV-B光が細胞増殖を一定程度抑制する結果を得た。しかし、実験の遂行を通じて、屋外の太陽光を光源とする実験では光強度が天候に左右されるので、直射光とUV光カットフィルターを通した光との間の増殖度の差は1.5~4.6倍にばらついて値を安定させることが困難であった。さらに、より詳細に実験結果を検討した結果、UV光のみならず、むしろ「UV光を含まない可視光」の強度自体の変化が細胞増殖により多大な影響を及ぼすという課題が明かになった。従って、次年度以降は、このテーマについては、人工光としてのUV光源や、太陽光の直射光の強度レベルに近い強光照射のできる人工可視光光源を用い、これらの及ぼす細胞増殖への影響等を調べる実験を計画する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
次年度使用額が生じた理由は、当初計画に沿った必要物品を購入するに際し、もっとも高額なエレクトロポレーターについては付属品等の仕様や数量単位が多種類用意されていたので、購入金額の一次見積もり時点では比較的幅広い利用の可能性に対応できるような仕様としての導入を考えていた。しかし、より詳細に検討を重ねた結果、導入時点には必要最低限の仕様として購入した後に実際に活用してみてさらに必要な付属品等を追加購入する方がより合理的に限られた資金を有効活用できると判断したので、結果として一次見積もり時点よりは低い価格で購入したことによる差額が一時的に生じたのである。
今年度の予備的な実験により、エレクトロポレーターの活用に必要な付属品の仕様が明かになったので、次年度以降の予算とあわせて、必要物品の購入に使用する計画である。
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