2014 Fiscal Year Research-status Report
海洋生物からの新規キチナーゼの検索・機能解析および応用技術開発
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25450309
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
松宮 政弘 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (60150702)
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2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | キチナーゼ / 精製 / 機能解析 / cDNAクローニング / 発現 / 魚類 / 軟体動物 / 甲殻類 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 硬骨魚類胃キチナーゼの精製・性質・機能解析およびcDNAクローニング： マイワシ胃より45kDaおよび49kDaのキチナーゼを精製し、その性質、機能解析を実施した。またそれぞれの遺伝子SmChi-1、SmChi-2を取得した。演繹アミノ酸配列の比較より、SmeChi-1とSmeChi-2はいずれもシグナルペプチド、family18活性ドメイン、リンカー部、キチン結合ドメインにより構成されるが、他の硬骨魚類胃キチナーゼよりも長いリンカー部を有していた。両キチナーゼは酸性域で良く作用し、基質特異性は両者で異なる事を明らかにした。
２．軟体動物ミズダコ唾液腺キチナーゼの精製・機能解析： ミズダコ唾液腺より各種クロマトグラフィーを用いて42kDaキチナーゼを精製し、機能解析を実施した。本酵素は(GlcNAc)6を基質として用いた場合、(GlcNAc)n, (n=2-4)を生成し、(GlcNAc)n, (n=2, 3)は分解しなかった。(GlcNAc)n分解生成物にはβ-アノマーの増加が認められ、この性質はGHファミリー18キチナーゼのそれと一致した。
３．コウイカ肝臓キチナーゼのcDNAクローニング： コウイカ肝臓よりRT-PCRおよびRACE法を用いて1,508 bp（ORFは1,380bp）のcDNAを得た。他の生物との相同性は、ジャンボアメフラシのキトトリオシダーゼ-1様タンパク質と47%の一致を示すこと、肝臓で発現していることを明らかにした。
４．ガザミ中腸腺キチナーゼのcDNAクローニング： 既にガザミ中腸腺より１種のキチナーゼ遺伝子PotChi-1を得ているが、さらにRT-PCRおよびRACE法を用いて約2,232bp(ORFは1,470bp)の遺伝子PotChi-2を得た。PotChi-2は中腸腺のみで発現していることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２６年度実験計画の内、
「１．軟骨魚類ヨシキリザメ、マカスベ胃、その他数種の軟骨魚類胃キチナーゼならびに軟体動物マダコ、ミズダコ、その他数種の軟体動物唾液腺キチナーゼcDNAクローニング」については、ヨシキリザメ胃キチナーゼのcDNAクローニングについて論文発表し、他種サメについても実験に着手した。また、マダコ唾液腺キチナーゼの精製・性質を論文発表し、cDNAクローニングのための部分アミノ酸配列を明らかにした。
「２．甲殻類肝膵臓キチナーゼの精製・性質・機能解析および部分アミノ酸配列解析」については、ガザミ中腸腺より精製を試みて、その過程で得られた性状を学会発表した。なお、ガザミの本酵素は極めて不安定で変性しやすいことが判明したことより、cDNAクローニングに路線を変更し、キチナーゼ遺伝子PotChi-1のcDNAクローニングを論文発表し、PotChi-2のそれを学会発表した。
「３．硬骨魚類マサバ、アイナメおよびシログチ胃１型酸性キチナーゼ（AFCase-1）および２型酸性キチナーゼ（AFCase-2）全長cDNAを用いた大腸菌による発現系の改良」については、低温発現ベクターpColdシリーズを用いた発現ベクターの構築に成功し、現在発現条件の検討を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 大腸菌のみならず、酵母を用いた発現系の構築にも着手し、発現に関する研究を推進させる予定である。
2. 発現についてはαキチン（自然界に最も豊富に存在するキチン）分解能の高いキチナーゼ遺伝子を優先して進行させる予定である。
3. 多種の海洋生物よりキチナーゼのcDNAが得られ出したことより、さらに種を増やしてキチナーゼの系統樹解析（特に脊椎動物）にも力を注ぐ予定である。
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