2013 Fiscal Year Research-status Report
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25450404
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Iwate University |
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Principal Investigator |
高橋 透 岩手大学, 農学部, 准教授 (20355738)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 胎盤性ラクトジェン / ウシ / 妊娠 |
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| Research Abstract |
小課題1「bPLの酵素切断の可能性の探索と切断部位の同定」において、ヒト由来株化細胞である293細胞を用いてN末端にFLAGタグとHisタグを有する組換えbPLを発現させ、677 μgの精製bPLを得た。次いでこの組換えタンパク質を胎盤組織の培養上清とインキュベートして抗FLAG抗体でウェスタンブロットしたところ、インキュベーションによって32kDaの組換えタンパク質のC末端側が切断されて25kDa前後のN末端断片が生成する事を確認した。胎盤の培養上清を抗bPL抗体でウェスタンブロットすると、同様のサイズのバンドが検出された。この事から、胎盤の培養上清は組換えbPLのC末端側を切断する活性があり、これによって生じるN末端断片は胎盤組織の培養上清中にも存在している事が示された。
培養上清中に存在するbPLを切断する活性はタンパク質分解酵素によるものと想定し、組換えbPLがマトリックスメタロプロティナーゼ(MMP)によって切断を受けるか否かを検討したところ、MMP-8, -9および-13によって切断されて約25kDaのN末端断片が生成した。MMP-8および-13はコラゲナーゼ、MMP-9はゼラチナーゼであることから、胎盤の培養上清中のMMP活性をカゼインザイモグラフィとゼラチンザイモグラフィで検討したところ、胎盤培養上清中の両酵素の活性が証明された。MMP-13のmRNA発現をin situハイブリダイゼーションで検討したところ、MMP-13は栄養膜細胞で発現している事が示された。
以上の成績から、ウシの胎盤の培養上清中にはbPLを切断する活性があり、MMPがbPLの酵素切断に関与している事が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究で、研究全期間を通じて使用可能な量の組換えbPLを作成した。このbPLは、天然型のbPLに類似した糖鎖付加があり、生物活性も天然型に遜色ない事が確認されている（未発表データ）。また、今年度は胎盤の培養上清中にbPL切断活性がある事を確認し、MMP活性が存在する事も確認した上で、MMPがbPLを切断してN末端断片を生成する事を示した。よって、本研究は今年度の計画に沿って概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度の研究計画
小課題2. bPLのN末端断片のPRL様生物活性と血管内皮細胞増殖活性の評価
上記の小課題1で明らかになったbPLの酵素切断部位に関する情報を元にbPLのN末端断片を組換え発現で作成する。申請者は予備実験を行った結果、人為的に短縮したポリペプチド断片の発現はうまく行かない事が多いことを経験している。そこで、本研究ではbPLをコードする配列にサイレント変異を導入することによって翻訳効率を高めて効率的に組換えタンパク質を生産する。申請者が他のタンパク質で実験してみたところ、変異挿入の効果は高く十分な量のタンパク質を得る事が期待される。サイレント変異のデザインはウェブベースのソフトで対応する。
完全長とN末端断片のbPL組換えタンパク質を取得した後に、これらのタンパク質の子宮・胎盤における標的細胞を探索する。即ち、子宮や胎盤の組織の凍結切片とこれらの組換えタンパク質をインキュベートし、組換えbPL（完全長又はN末端断片）が組織の標的細胞に結合してから切片を架橋剤でクロスリンクしてリガンドと受容体の結合を固定する。次いで、結合したリガンドを抗FLAG抗体で免疫染色して切片中の標的細胞に結合したリガンドを検出する。bPLのN末端断片の生物活性を評価する目的で、Nb2細胞を用いたPRL様生物活性の検定と血管内皮細胞を用いた細胞増殖に及ぼす作用を検討する。
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