新興アルボウイルスの牛に対する病原性の病理学的研究

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25450435
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 田中 省吾 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究所温暖地疾病研究領域, 主任研究員 (10355216)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 梁瀬 徹 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究所温暖地疾病研究領域, 主任研究員 (90355214)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: アルボウイルス / 牛胎子骨格筋由来筋芽細胞 / 感染親和性 / 牛胎子感染実験

Outline of Annual Research Achievements

新興アルボウイルスの一種であるピートンウイルス（以下PEAV）の牛に対する病原性の有無と病態を明らかにするため、異なる胎齢の牛胎子骨格筋由来筋芽細胞および牛胎子にPEAVを接種し、in vitro系ではアカバネウイルス（以下AKAV）との感染動態を比較するとともにin vivo系では流死産や体形異常等の病原性を再現することを試み、本年度は以下の結果を得た。
１）胎齢早期の牛胎子（胎齢84日）由来の培養筋芽細胞では接種後12時間以降、PEAVはAKAVに比較して4.7倍ゲノムコピー数が増加したが、胎齢中期（胎齢150日）の筋芽細胞では接種後48時間以降にPEAVよりAKAVのゲノムコピー数が増加した。また、胎齢後期（胎齢216日）の筋芽細胞ではいずれのウイルスも増殖性は低下し、接種後12時間以降でAKAVの方がゲノムコピー数は多かった。
２）妊娠母牛の胎子（胎齢146日）に子宮外から外科的にPEAVを接種した。接種後28日目から41℃を超える体温上昇が１週間ほど継続した後、平熱に復したが発熱から18日後に妊娠192日で流産した。流産した母牛は、PEAV接種後2週間でPEAVに対する抗体価が64倍に上昇していた。流産胎子には病理解剖学的な異常は認められなかったが、PEAVに対する抗体価は、剖検時64倍で感染していたことが証明された。
３）妊娠母牛2頭の胎子（胎齢149日および159日）に同様にPEAVを接種したところ、接種後138日および132日に自然分娩で娩出された。妊娠期間は、それぞれ287日と291日でいずれの新生子にも病理解剖学的な異常はみられなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、初年度に確立した胎齢早期、中期および後期の牛胎子骨格筋由来筋芽細胞を用いてPEAVとAKAVの増殖性の比較を試みた。その結果、胎齢早期の培養筋芽細胞においてのみPEAVはAKAVに比較して著しい増殖がみられたことから、PEAVはAKAVに比べて胎齢早期の牛胎子の骨格筋に感染しやすく、野外で観察されるPEAV発症異常産子にみられる骨格筋の脂肪置換等の特徴病変形成に関与することが明らかにされた。確立した牛胎子骨格筋由来の筋芽細胞を用いたin vitro系の感染実験は、次年度以降もシャモンダウイルス等の新興アルボウイルス感染実験にも応用が可能であり、新興アルボウイルス感染による骨格筋の脂肪置換を主徴とする病態を解明する上で有効な手法であると思われる。
また、本年度から計画されていた妊娠母牛を用いた牛胎子へのPEAV感染実験が実施された。PEAV接種母牛３頭中１頭に流産が再現され、新生子には関節彎曲や骨格筋の脂肪置換等の病理解剖学的な異常は認められなかったが、母子ともにPEAVに対する抗体価の上昇が認められ、異常産を起こす病原性を確認することができた。
PEAVの牛胎子に対する病原性は、in vitro系感染実験で明らかにされたように感染時の胎齢が早期であるほど感受性が高いと思われる。しかし、牛胎子に直接ウイルスを接種する本手法は、胎齢早期では接種自体が困難であるとともに接種による胎子の死亡リスクも高まることから、胎齢120日程度が適応の限界である。そこで今後の牛胎子を用いた感染実験では胎齢120～150日にPEAV接種後、7～10日目の比較的早い時期に剖検・採材してウイルス感染部位や病変形成の検索が主体となる。

Strategy for Future Research Activity

次年度は、確立した牛胎子骨格筋由来筋芽細胞を用いたin vitro系感染実験を用い、PEAV以外の新興アルボウイルスの一種シャモンダウイルスについてPEAVと同様にウイルス増殖の動態をリアルタイムRT-PCR法によるウイルス遺伝子定量法で測定する。その結果をAKAVやPEAVの筋芽細胞における増殖親和性と比較し、骨格筋の脂肪置換に関する病理発生との関連を明らかにする。
また、前年度得られたPEAV接種後に分娩された牛胎子については、抗体価やウイルス分離等のウイルス学的検査を実施するとともに主要臓器や中枢神経系組織を主体に病理組織学的検査や免疫組織化学的検査を行い、牛胎子内でのウイルス増殖部位や病変形成を解析し、PEAV感染に起因する病原性を明らかにする。
さらに牛胎子にPEAVを外科的接種後、10日程度経過時点で胎子を摘出してウイルス学的および病理組織学的検査を実施し、PEAV感染によって形成される初期病巣を検索して病理発生機序を解明する。

Research Products

• [Journal Article] Bovine Aroboviruses in Culicoides Biting Midges and Sentinel Cattle in Southern Japan from 2003 to 2013 (2015)
  • Author(s): Kato,T., Shirafuji,H., Tanaka,S., Sato,M., Yamakawa,M., Tsuda,T. and Yanase,T
  • Journal Title: Transbound Emerg Dis Volume: なし
  • DOI: 10.1111/tbed.12324
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant