犬のリンパ腫における薬剤耐性関連miRNAの探索と耐性克服の基礎的研究

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25450445
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 木之下 明日香 (瀬戸口 明日香) 鹿児島大学, 獣医学部, 准教授 (00396813)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 犬 / リンパ腫 / 細胞株 / 薬剤耐性 / miRNA

Research Abstract

本年度は、犬リンパ腫由来細胞株からの薬剤耐性株の樹立を主に実施した。犬リンパ腫由来細胞株はT細胞性リンパ腫由来細胞株であるCL-1およびB細胞性リンパ腫由来細胞株GL-1を用い、使用薬剤はドキソルビシン（DOX)およびビンクリスチン(VCR)を使用した。各細胞株の状態が安定し、増殖率およびcell viabilityが90%以上であることを確認後、薬剤を培養液に添加し、薬剤耐性株の作成を開始した。低用量（DOX 1ng/ml, VCR 0.05 ng/ml)から開始すると、添加直後より各細胞株のcell viabilityは15%程度まで低下し、死滅細胞が増えたが、60%を越える状態まで回復し、細胞増加が認められた時点で、薬剤濃度を上げていった。薬剤濃度がDOX 10 ng/ml, VCRが1ng/mlまで上昇し、薬剤耐性の獲得が考えられた時点でMTTアッセイを行い、IC50値を親株と比較したところ、IC50値がDOXは2倍、VCRは1.5倍であった。各薬剤のIC50が４倍まで上昇した時点でのmiRNA発現について比較予定であったため、その後も薬剤濃度を上昇させていったが、薬剤濃度の上昇に従い細胞は薬剤耐性を獲得できずに死滅した。これらの過程を２回繰り返したが、同様の結果であったため、薬剤耐性を獲得しにくい細胞株である可能性を考慮し、耐性株の作成を別の細胞株に変更した。現在、UL-1およびCLC細胞株から薬剤耐性株の作成を行っている段階であり、作成できしだいmiRNA発現解析を行う予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

薬剤耐性株の作出が予定よりも遅れている。以前、本研究室で作成し保存した薬剤耐性株も存在したが、長期の保存により親株と同レベルの耐性度であったため、再度耐性株を作成する必要があったことが一番の問題である。また、２種の細胞株に関して２薬剤での耐性作出を２度試みたが、薬剤濃度の上昇に伴い、細胞が死滅したため、急遽別の細胞株で耐性株作出を試みている。

Strategy for Future Research Activity

本年度3ヶ月程度で薬剤耐性株の作出を終了し、早々にmiRNAの発現解析を実施したい。また、miRNAのみならず薬剤耐性株と親株が作出できた時点で研究方法を変更し、次世代シークエンサーによるmRNA発現解析も平行して実施することも検討している。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

本年度、耐性株の作成完了しだい、miRNAアレイによる発現解析を行う予定であったが、耐性株の作成に遅れが生じたため、そちらに使用する予算が次年度に繰り越しとなった。
本年度、早期に耐性株の作成を行い、miRNAアレイ解析を実施する予定である。