2013 Fiscal Year Research-status Report
視床下部視索上核ニューロンの浸透圧感知に関わる分子実体の解析
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25450464
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
澁谷 泉 鳥取大学, 農学部, 教授 (50162649)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北村 直樹 鳥取大学, 農学部, 准教授 (80301951)
浅野 淳 鳥取大学, 農学部, 准教授 (90312404)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 視索上核 / バゾプレシン / オキシトシン / TRPV1 / 浸透圧 / RT-PCR / パッチクランプ / 細胞内Ca2+濃度 |
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| Research Abstract |
1.ラット視索上核ニューロンが発現するTPRV1関連分子について詳細なRT－PCRを行い、視索上核の組織内に、TRPV1の全長分子が含まれていること、さらに、複数のN端変異分子も含まれていることを解明した。
2.急性単離したラット視索上核ニューロンを用いてパッチクランプ法で活動電位発生頻度ならびに、膜電流を解析したところ、TRPV1のアゴニストであるカプサイシンには応答がないものの、浸透圧物質である50mMマニトール（約30mOsmol/kg）に対して著明な膜電位ならびに電流応答を示すニューロンが存在し、これらの応答がTRPV1の選択的アンタゴニストであるCapsazepineで可逆的に抑制されることが明らかとなった。
3.急性単離したラット視索上核ニューロンを用いてFura-2による細胞内Ca2+濃度([Ca2+]i)画像解析法で[Ca2+]iを解析したところ、50mMマニトールに対して著明な[Ca2+]i上昇応答を示すニューロンが存在し、その応答がCapsazepineで可逆的に抑制されることが明らかとなった。
4.潅流液の温度を36度にして、カプサイシンを作用させたところ、視索上核ニューロンがCapsaisin 100nMに応答し、その反応はCapsazepineで抑制されることが明らかとなった。
5.eGFP-AVPラットとmRFP-OTラットを用いて、GFP/RFP蛍光を指標に視索上核のバゾプレシンニューロンとオキシトシンニューロンを目視で区別し、[Ca2+]の画像解析を実施する手法を確立した。この手法を用いて、浸透圧刺激に応答するニューロンを特定したところ、バゾプレシンニューロンのみが応答することが判明した。
以上の結果より、視索上核のバゾプレシンニューロンのみが浸透圧感知分子として全長TRPV1を含む分子を有していることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本体が不明であった中枢の浸透圧感知分子（Central Osmoreceptor）について、その候補分子としてラット視索上核に全長TRPV1のmRNAが存在すること、その配列がTRPV1とまったく同一であることを確定できた。これは、マウスで得られていた視索上核にはTRPV1のN端変異分子のみが存在するとした過去の知見と大きく異なる結果であった。
さらに、急性単離ニューロンを用いて、バゾプレシンニューロンのみが、浸透圧感知機能を有していること、さらには、温度依存性にCapsaisinにも応答しうることを見いだした。これらの結果は、Central Osmoreceptorの一部にTRPV1全長分子が含まれていることを強く意味しており、長らく不明であった、Central osmoreceptorの分子実体に大きく近づいたといえる。さらに、当初考えていたTRPV1分子が他分子と複合体を形成している可能性よりも、TRPV1全長分子と変異分子のヘテロマルチマー形成の可能性を優先して検索すべき結果であったために、次年度以降の計画を一部変更することとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.全長TRPV1分子と、それ以外にいくつか見つかったN端変異分子を単独で、あるいは組み合わせてHEK-293細胞に発現させる。発現レベルはGFPあるいはRFPを共発現させて、蛍光を指標に特定する。
2.TRPV1関連分子を発現させたHEK-293細胞で、細胞内Ca2+濃度画像解析とパッチクランプによる解析を実施し、浸透圧刺激ならびにTRPV1関連試薬による刺激を組み合わせて得られる細胞応答を、視索上核ニューロンの応答、背根神経節の応答と比較検討する。
3.視索上核ニューロンのCapsaicin応答性について、温度依存性、受容体刺激との組合せ、脱感作などに着目し、より詳細に解析する。
4.視索上核ニューロン以外にTRPV1全長分子を発現する細胞を視床下部で検索し、それらの細胞での浸透圧応答を解析する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
H25年度の成果により、中枢性浸透圧受容器がTRPV1全長分子自身が形成するヘテロテトラマーである可能性が極めて高くなったために、イーストのトゥハイブリッドシステムを用いた新たな分子検索の計画に進むのではなく、視索上核において発現しているTRPV関連分子の検索を行う方針変更を行ったため、イーストを用いた実験系に準備していた実験器具ならびに消耗品費等を使用しなかったため。
上記の変更によって生じた残額は、H26年度での学会発表および、H26年度の実験計画で活用することとした。
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